马拉巴石斑鱼Piscidin的改造体抗菌肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 现行化学药剂和抗生素的滥用和大剂量，很容易使耐药性菌株日益增多，菌群 失调和医院交叉感染等已成为现时医院中急待解决的一大难题，严重危害着人类的健 康。环境恶化以及温室效应也加速了抗药性和抗疫苗的病原体菌株的进化（Peneau et al.，2007)，而抗菌肽的发现为解决这些难题提供了新的方向。抗菌肽是一类具有广谱抗 微生物活性的小分子多肽，广泛存在于生物界中，是先天性免疫系统中重要的非特异性免 疫因子。抗菌肽具有分子量小，热稳定和水溶性好等特点，其作用机理不同于传统抗生素， 使用后对细菌不易产生耐药性，并且抗菌肽进入机体后代谢速度非常快，不会在机体中产 生有害残留。由于抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌具有很强的杀灭作用，而且还能够杀 灭对抗生素产生耐药性的病原体，另外有报道指出抗菌肽对真菌、病毒、原生动物甚至肿 瘤都具有杀伤作用。因此，抗菌肽有望开发成为一类新型高效抗菌药物或辅助治疗药物， 在临床医学、食品及化妆品防腐、饲料添加剂等领域具有广阔的开发应用前景（Thomas et al. , 1996 ；Alexandra et al. , 2006 ；Dong et al 2012)〇〇
[0003] 但是，另一方面，尽管抗菌肽对微生物细胞膜的作用具有选择性，而体外试验发 现较高浓度的抗菌肽也会破坏真核细胞，包括对红细胞的溶血作用、对淋巴细胞等的破坏 等（Sun et al.，2006)。因此，发掘自然界中高效、新型的抗菌肽是人们关注的一方面，同时 人们还关注对自然抗菌肽的改造，以期提高抗菌肽抗菌活性的同时降低其对机体本身的毒 性，这已成为抗菌肽研究中的新热点。
[0004] 细胞选择性是指抗菌肽对不同细胞的生物学活性不同。抗菌肽疏水性和电荷性对 抗菌肽的细胞选择性影响很大（Ma et al.，2011)。早期研究主要是通过特定的氨基酸替 换以提高抗菌肽螺旋度，从而提高抗菌肽对细胞膜的亲合力，提高抗菌活性。Zhu等（Zhu et al.，2006)使用N-取代甘氨酸类酸性化合物N-trp替代风毒素 Melittin (ME)第19位 Trp，合成了螺旋含量低于Melittin的类似物ME-w。实验显示，ME-w与ME虽然对6中测试 细菌和白假丝酵母的抗菌性基本相同，单对膜呈电中性的hRBC、HeLas和NIH-3T3细胞的毒 性大大降低。
[0005] 也有研究者发现，用D-型氨基酸替代肽v681的11位和13位L一型氨基酸获得一 系列V681的衍生肽，发现大多数D-型氨基酸衍生肽比其原型氨基酸肽的抗菌活性更高，但 是溶血活性很高，并因此认为高螺旋度是其具有溶血性的原因之一（Chen et al.，2005)。 其后，Chen等报道用D型氨基酸替换其同分异构体L型氨基酸，小利于肽链螺旋形成，降 低螺旋含量，同时并不改变其净电荷数和疏水性，足以提供研究抗菌肽螺旋度与抗菌活性 和溶血活性关系的有效方法（马清泉等，2011)。最近研究显示，LK替代的多肽序列在 64 μ mol/L时引起50%的人血细胞发生溶血（王良等，2014)，而马清泉等设计的VGR16在 256 μ mol/L时仍然没有溶血活性（马清泉等2011)，这表明V的替换在降低抗菌肽溶血活 性方面具有重要的应用价值。
[0006] 另外，Zhao等（2013)通过对多肽Bac2A的改造验证显示，可以根据不同细胞膜的 磷脂双分子层中不同磷脂的比例，以及氨基酸的能量从而决定不同的氨基酸需要在不同的 位置就能达到定向的改变目的，其中氨基酸W，R被其强调效果尤为明显，但是也只能说明 在Bac2 (ARLARIVVIRVAR-NH2)这个短的多肽序列可能比较合适，但是其改造 Bac2库也只有 约22%出现了能够降低溶血活性的现象，所以也只能说是验证了 W、R氨基酸可能有一定的 降低溶血活性的功能，真正定向的改变多肽的部分功能尚未成熟，仍为大家在努力探索的 方向。
[0007] 可见，具有a-螺旋式类抗菌肽功能有效的的结构基础，适宜的两亲性和正电荷 数可能是其具备高抗菌活性和低溶血性的关键。正电荷过高会阻碍抗菌肽穿膜孔道的形 成；高疏水性和螺旋度是α-螺旋抗菌肽具溶血性的主要原因。在分子设计中须综合考虑 螺旋度、两亲性、疏水性和净正电荷等结构参数，既要遵守共性原则也要考虑各自特殊性的 要求。
[0008] Silphaduang等（2001)首次从海洋鱼类杂交条纹S卢（M. chrysops X M. saxatilis)肥大细胞中分离出Piscidin,发现该抗菌肽对鱼类的几种病原菌最小抑制 浓度低达1.2ymol/L。随后人们发现Piscidin具有广谱的抗菌活性，而且对病毒、真菌乃 至寄生虫也均有一定的抑制作用（Noga et al.，2003 ;Noga et al.，2009)。近十年的研究 表明，piscidins是鱼类特有的一个抗菌肽家族，并广泛存在于鲈形目、鳕形目等鱼类中， 是一类线性、两亲性、具有典型α螺旋结构的小分子阳离子抗微生物多肽，抗菌谱广、杀菌 能力强，并具有抗病毒甚至抗寄生虫等活性（Silphaduang et al.，2006)。
[0009] 发明人前期研究显示，从马拉巴石斑鱼（Epinephelus malabaricus)中获得的 Piscidin 基因（GenBank:JX412480)，其 mRNA 编码的氨基酸序列为（MRCIALFLVLSLVVLMA EPGEGFFFHIIKGLFHAGRMIHGLVNRRRHRH GMEELDLDQRAFEREKAFA)。通过合成其预测成熟肽 (FFFHIIKGLFHAGRMIHGLV)，抑菌实验表明具有极强的杀菌活性，但同时具有较高的溶血活 性。因此该抗菌肽是非常值得改造的目标抗菌肽。该序列原始是从马拉巴石斑鱼克隆得出 的多肽，因此可以将其视为天然肽Piscidin,简写为emPis-wt。根据piscidin本身的亲水 性疏水性与抗菌活性、溶血活性的矛盾关系，需要推测出适当的降低多肽序列的疏水性增 强其亲水性，同时能够保持其高性能的杀菌活性，究竟应该怎样去降低怎样去改变，这没有 成熟的方案，没有固定的原则，这无疑增强了改造的困难性。
[0010] 虽然有报道指出，κ是带有正电荷的氨基酸，使得肽带有净正电荷，它可与细菌表 面带有负电荷的脂多糖发生静电吸引作用，使抗菌肽吸附在细菌表面；L是疏水性残基，使 得肽具有很强的疏水性，它可渗入脂质双分子层破坏细胞膜的结构，改变细胞的渗透性，进 而发挥杀菌作用（Teixeira V，et al，2012)但是，究竟应该将K替代在什么位置，是不是替 代的越多就越好，这也是存在很多不确定因素。
[0011] 另外，虽然很多人尝试选择用D型氨基酸提高多肽的活性，但是也存在着一些问 题：第一，合成的成本太高；第二，与天然存在的多肽为L型不符合，这无疑会为后续实验及 将来的大规模生产、应用造成一定的困难。于是本发明着手既能够在既符合天然存在规律， 又实现多肽的改造，保持高的抑菌活性，同时极为显著地降低了溶血活性和细胞毒性，这无 疑将为未来抗菌肽的规模化、产业化应用提供无可比拟的价值。
【发明内容】
[0012] 本发明的一个目的是提供一种马拉巴石斑鱼piscidin的改造体抗菌肽。
[0013] 本发明的另一个目的在于提供编码所述改造体抗菌肽的基因。
[0014] 本发明的另一个目的在于提供了一种含有上述编码改造体抗菌肽基因的重组表 达载体。
[0015] 本发明的也提供所述马拉巴石斑鱼piscidin的改造体抗菌肽的应用。
[0016] 根据本发明的一方面，本发明通过将从马拉巴石斑鱼（Epin印helus malabaricus)中获得的 Piscidin 基因（GenBank: JX412480)，其 mRNA 编码的氨基酸 序列如 SEQ IDN0. 5 所示(MRCIALFLVLSLVVLMAEPGEGFFFHIIKGLFHAGRMIHGLVNRRRHRHGM EELDLDQRAFEREKAFA)，通过合成其预测成熟肽为：FFFHIIKGLFHAGRMIHGLV，经改造获得人工 肽（pisL9K22WK)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，包含23个氨基酸其等电点、相对分子 质量为Pl/Mw: 11. 26/2801. 46,并经抑菌实验证明经改造的人工肽具有与天然抑菌肽相近 的抑菌活性，且溶血活性和细胞毒性大大降低。
[0017] 根据本发明的另一方面，针对不同的表达系统，对编码上述改造体抗菌肽的基因 序列进行了密码子优化，其中适于在衣藻中表达的编码本发明抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，适于在酵母中表达的编码本发明抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示， 适于在大肠杆菌中表达的编码本发明抗菌肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0018] 根据本发明的又一方面，含有上述编码改造体抗菌肽基因的表达载体优选为衣 藻、酵母或大肠杆菌表达载体。
[0019] 根据本发明的再一方面，本发明的改造体抗菌肽可应用于动物饲料、药物等领域。
[0020] 本发明的马拉巴石斑鱼piscidin的改造体抗菌肽保持了与天然抗菌肽piscidin 相接近的杀菌活性的同时，显著降低了溶血活性以及细胞毒性，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1为三条改造的多肽与emPis-wt的氨基酸序列对比；
[0022] 图2为emPis-wt及3条改造肽的疏水性分析，其中a为emPis_wt，b为pisL9K20， c 为 pisL9K22TG，d 为 pis L9K22WK ;
[0023] 图3为emPis-wt及3条改造肽的螺旋轮图，其中a为emPis-wt，b为pisL9K20，c 为 pisL9K22TG，d 为 pis L9K22WK ;
[0024] 图4为emPis-wt及3条改造肽的二级结构预测，其中a为emPis-wt, b为 pisL9K20, c 为 pisL9K22TG，d 为 pis L9K22WK ;
[0025] 图5为pisL9K20氨基酸序列在NCBI库同源性对比；
[0026] 图6为pisL9K22TG氨基酸序列在NCBI库同源性对比；
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