成骨细胞和制备成骨细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及成骨细胞和制备成骨细胞的方法，并且更具体地设及通过直接重编程 制备成骨细胞的方法.
[0002] 发明背景
[0003] 可W期望将成骨细胞移植至受累区域W修复由骨肿瘤、创伤、骨髓炎等导致的骨 缺损或者骨肿瘤等的刮除术之后的骨缺损能够促进骨形成并改善功能和形态学预后。事实 上，已经实施了通过收集自例如患者的松质骨的骨髓细胞的自体移植进行的治疗，并且治 疗的效果是已知的。在此类情况下，通过自体骨髓细胞中包含的间充质干细胞的分化诱导 获得的成骨细胞被认为有助于骨形成和骨重塑。同时，骨质疏松症患病率的增加与人口老 龄化相一致，并且老年人骨折可能导致长期邸床。成骨细胞的移植被认为能够促进由骨质 疏松症、创伤等导致的骨折，难治性骨折W及假骨折的治愈。此外，成骨细胞的移植也可W 用于例如：类风湿性关节炎、特发性股骨头坏死、变形性关节病、变形性腰椎关节强硬 (lumbar spondylosis deformans)、椎管狭窄症、椎间盘突出、脊椎滑脱、崩裂性脊柱滑脱、 脊柱侧凸、脊髓型颈椎病、后纵初带骨化、脊髓损伤、髓关节病、膝关节病、股骨头骨號滑脱、 骨软化症、术后骨修复(如屯、脏手术之后的胸骨修复）、与人工踩关节手术相关的缺损修复、 骨髓炎W及骨坏死。
[0004] 另一方面，牙周病可被称作第四生活方式相关疾病，在人群中发病率很高，并且引 起各种全身性疾病。随着牙周病的进展，发生牙槽骨的骨吸收。因此，当高效地向局部骨吸 收部位提供成骨细胞时，可W再生并治疗牙槽骨。
[0005] 当将成骨细胞的移植与骨移植、人工骨移植、人工关节和埋植剂组合时，可W增强 治疗效果。
[0006] 迄今为止已经将骨髓间充质干细胞、包括骨髓间充质干细胞的骨髓细胞等用作此 类成骨细胞用于移植。然而，骨髓的收集存在问题。例如，收集对于患者具有高度侵害性，并 且在一些情况下不能提供足量的骨髓细胞。另一方面，使用人胚胎干细胞化S细胞)不需要 从患者身上收集骨髓，并且可W提供足量的成骨细胞，但是除伦理问题外，可能会引起移植 之后剩余的ES细胞的肿瘤发生的风险。此外，使用iPS细胞不需要从患者身上收集骨髓，并 且可W提供足量的成骨细胞，但是可能会引起移植之后剩余的细胞的肿瘤发生的风险。
[0007] 在非专利文献1中，公开了向人ES细胞中导入包括Osterix的慢病毒载体，W及在 成骨细胞培养基中分化诱导为成骨细胞。
[000引在非专利文献2和非专利文献3中，公开了通过在成骨细胞培养基中分化诱导将小 鼠细胞转化为MSC来制备成骨细胞。
[0009] 在非专利文献4中，公开了通过向小鼠 iPS细胞中导入包括Runx2的腺病毒载体并 在成骨细胞培养基中将细胞进行分化诱导来制备成骨细胞。
[0010] 如在非专利文献1至非专利文献4中公开的，通过分化诱导从多能干细胞如ES细胞 和细胞制备成骨细胞，因此该方法需要长期培养并存在致癌作用的风险。
[0011] 例如，基于当将组织特异的转录因子的基因群组导入体细胞时，可W在不转变为 iPS细胞的情况下实现直接分化诱导为组织细胞(直接重编程(直接转化））运一事实，已经 做出了下述报导：
[0012] 小鼠成纤维细胞一软骨细胞(导入S0X9+Klf4+c-Myc基因），
[0013] 小鼠成纤维细胞一屯、肌细胞（导入GATA4+Mef2c巧b巧基因），
[0014] 小鼠成纤维细胞一肝细胞（导入!1址4〇+(。〇皿1^〇皿2或化皿3)基因），
[0015] 小鼠成纤维细胞一神经干细胞（导入例如Sox2+FoxGl基因）和小鼠细胞或人细胞 ^造血干细胞。
[0016] 然而，没有体细胞直接转化为成骨细胞的报导。
[0017]引用列表
[0018] 非专利文献
[0019] [NPL 1化arner E et al.J Cell Physiol.2009.
[0020] [NPL 2]Li F et al.J Cell Biochem.2010.
[0021] [NPL 3]Biloussova G et al.Stem cells.2011.
[0022] [NPL 4]Tashiro K et al.Stem cells.2009.
[0023] 发明概述
[0024] 技术问题
[0025] 本发明的目标是提供制备成骨细胞的方法，所述成骨细胞适用于修复由各种肿 瘤、损伤、手术等导致的骨缺损W及治疗W牙周病、骨折、骨质疏松症等为典型的骨吸收，并 且具有较低的致癌作用风险。
[0026] 解决方案
[0027] 本发明的发明人发现在不转化为多能干细胞，如ES细胞和细胞的情况下，可W 通过向哺乳动物的体细胞中导入组合的特异性基因直接获得成骨细胞(直接重编程）。
[0028] 根据本发明的实施方案，提供了下述成骨细胞及其制备方法。
[0029] 项1.从哺乳动物的体细胞制备成骨细胞的方法，所述方法包括向体细胞中导入重 编程相关基因或其表达产物，所述重编程相关基因包括选自Oct家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、 化IS家族、Klf家族、Lin-28W及Sox2中的至少一种。
[0030] 项2.从哺乳动物的体细胞制备成骨细胞的方法，所述方法包括向体细胞中导入骨 相关基因或骨相关基因的表达产物W及重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，所 述骨相关基因包括选自Runx2 (R)、0sterix(0)和D1巧（D)的至少一种，所述重编程相关基 因包括选自Oct家族、。-]\17(3(]\〇、1-]\17(3化）、化15家族、1(^家族、^11-28和5〇义2中的至少一 种。
[0031] 项3.如项1或项2所述的方法，其中所述体细胞包括成纤维细胞或牙銀细胞。
[0032] 项4.如项1至3中任一项所述的方法，其中所述重编程相关基因或其表达产物包括 0ct4〇
[0033] 项5.如项4所述的制备成骨细胞的方法，其中待被导入所述体细胞的重编程相关 基因或其表达产物包括0ct4、0ct化、0ct4M、0ct化M、0ct化Glis巧日Oct化MGlisl之一，其中Μ 代表"c-Myc"，W及L代表"L-Myc"。.
[0034] 项6.如项1至3中任一项所述的方法，其中待被导入体细胞的骨相关基因或骨相关 基因的表达产物与重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物的组合包括选自下述的 一种组合：0ct4、0ct化MGlisUROD Oct化、畑 Oct化、RO 0ct4ML、D 0ct4ML、R0D 0ct4M、0D Oct化、0 0ct4ML、0 Oct化、0 0ct4M、0D 0ct4、D Oct化、0ct4ML、R0D 0ct4ML、畑 0ct4ML、0D 0ct4ML、0 0ct4MLGlisl、畑 0ct4M、R Oct化 GlisUR 0ct4ML、0D 0ct4M、0 Oct化 Glisl、 ROD 0ct4、R0 0ct4M、R0 0ct4L、R0 0ct4、0 0ct4Glisl、RD 0ct4、0ct4L Glisl、D 0ct4M、D 0ct4Glisl、0 0ct4、0ct化、0ct4M、D 0ct4、R0 0ct4K、R0 0。145〇义2、^及1?0 Oct4Lin28,其 中R代表"Runx2"，0代表"Osterix"，D代表"Dlx5"，M代表"c-Myc" W及L代表"L-Myc"。
[0035] 项7.如项1至3中任一项所述的方法，其中待被导入体细胞的骨相关基因或骨相关 基因的表达产物与重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物的组合包括选自下述的 一种组合：ROD Oct化、RD Oct化、R0 0ct4ML、D 0ct4ML、R0D 0ct4M、0D Oct化、0 0ct4ML、0 Oct化、0 0ct4M、0D 0ct4、D Oct化W及0ct4ML，其中R代表'书unx2"，0代表"0sterix"，D代表 "Dlx5"，M代表 "c-Myc"，W及L代表 "L-Myc"。
[0036] 项8.如项2或3所述的方法，其中待被导入体细胞的骨相关基因或骨相关基因的表 达产物与重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物的组合包括选自下述的一种组合： ROD Oct化、畑 Oct化、R0 0ct4ML和D 0ct4ML。
[0037] 项9.成骨细胞，其来源于哺乳动物的体细胞，并且其包括重编程相关基因或其表 达产物，所述重编程相关基因包括选自0ct4、c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS家族、Klf家族、Lin- 28和Sox2中的至少一种。
[0038] 项10.成骨细胞，其来源于哺乳动物的体细胞，并且其包括骨相关基因或骨相关基 因的表达产物W及重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，所述骨相关基因包括选 自Runx2 (R)、0ste;rix(0)和01巧（D)中的至少一种，所述重编程相关基因包括选自0ct4、 c-Myc(M)、L-Myc(L)、GLIS 家族、Klf 家族、Lin-28 和 Sox2 中的至少一种。
[0039] 本发明设及通过导入重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，或者骨相关 基因或骨相关基因的表达产物W及重编程相关基因或重编程相关基因的表达产物，从体细 胞制备成骨细胞的技术。可将选自Runx2 (R)、0sterix(0)和D1巧（D)的至少一种作为那些 基因中的骨相关基因。所述基因可取地包括Oxterix和D1巧中的至少一种。此外，可将选自 下述基因的至少一种选择作为重编程相关基因：0ct4家族、c-Myc(M)、L-Myc(L)、Glis家族、 K1 f 家族化LF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、 KLF14、KLF15、KLF16和KLF17)、Lin-28W及Sox2。所述重编程相关基因可取地包括0ct4家族 中的至少一种，更可取地包括0ct4家族和L-Myc和/或c-Myc中的至少一种。在0ct4家族中， 0ct4是可取的。因此，所述重编程相关基因最可取地包括0ct4和L-Myc和/或c-Myc。
[0040] 可与如上文所述相同的方式使用Oct家族的其它基因来代替0ct4。通常，0ct4 可W表示为0ct3/4,但是在本说明中将其表示为"0ct4"。在该说明中，虽然"0ct4"被用于描 述为Oct家族的代表，但是也可与0ct4相同的方式使用Oct家族的其它基因（OctlA和 0ct6)。
[0041 ] 0ct4是用于通过与Sox2、Klf4和c-Myc-起基因导入体细胞而重编程体细胞W诱 导专能性的因子（Tak址ashi K，Yamanaka S.Cell ,126(4) :663-76,2006;Tak址ashi K, Tanabe K,0hnuki M,Narita M,Ichisaka T,Tomoda K,Yamanaka S.Cell.131(5):861-72, 2007)。已知将GATA3、GATA6、S0X7、PAXl、GATA4、CEBPa、HNF4a、GRB2等中的任何一种而非 0ct4与Sox2、Klf4和c-Myc-起基因导入体细胞能够重编程体细胞W诱导专能性（Shu et al.Cell 153:963,2013)。在本发明中也可W使用既非重编程因子又不属于Oct家族但是可 W具有可替代重编程中的Oct的功能的因子来代替0ct4,所述因子如GATA3、GATA6、S0X7、 PAX1、GATA4、CEBPa、HNF4a和GRB2。换言之，在该说明中，术语"Octr被用于描述为能够具有 重编程中的0ct4的功能的代表性因子，但是也可与0ct4相同的方式使用具有可替代重 编程中的 Oct 的功能的因子，如:GATA3、GATA6、S0X7、PAX1、GATA4、CEBPa、HNF4a 和 GRB2。
[0042] 也可 W 用 Klf 家族的任何其它基因化 LF1、KLF2、KLF3、KW5、KLF6、KLF7、KLF8、 化尸9、化尸10、化尸11、化尸12、化尸13、化尸14、化尸15、化尸16或化尸17)来替代化尸-4。在该说明中， 术语"KLF-4"被用于描述为Klf家族的代表，但是也可W W与KLF-4相同的方式使用Klf家族 的其它基因。
[0043] 作为化IS家族，给出了化IS1 (化IS家族锋指1)等。
[0044] 作为可W具有可替代体细胞的重编程(iPS细胞的诱导）中的KLF-4的功能的基因， 已知的不仅有KLF家族的基因，还有例如IRX家族的成员（如IRX6 (易洛魅（iroquois)同源 框蛋白6))、ΡΤΧ家族成员（如PITX2 (成对样同源结构域转录因子2))W及DMRTB1 (具有富 含脯氨酸的C末端1的DMRT样家族BKW02010/098419 (2010年9月2日））。在该说明中，术语 "KLF-4"被用于描述，但是可与KLF-4相同的方式使用可具有可替代在体细胞的重编程 (iPS细胞的诱导）中的KLF-4的功能的基因。也可W使用那些基因的产物，即mRNA。
[0045] 可与S0X2相同的方式使用SOX家族的其它基因来代替S0X2。在该说明中，术语 "S0X2"被用于描述为SOX家族的代表，但是也可与S0X2相同的方式使用SOX家族的其它 基因。
[0046] 在本发明中，为方便起见，所有基因都被称作S0X2。
[0047] 可将骨相关基因和重编程相关基因的表达产物用作代替骨相关基因和重编程相 关基因中的一种或多种的替代物。此外，可W将能够诱导或模拟基因的分子试剂等用作代 替骨相关基因和重编程相关基因中的一种或多种的替代物。作为可W具有可替代iPS细胞 的诱导中的0ct4的功能的基因，已知的有，例如GATA3、GATA6、S0X7、PAXl、GATA4、CEBPa、 HNF4a 和 GRB2 (Jian aiu et al.，Cell 153,963-975,2013)，因此可 W 使用此类化合物来 代替导入0ct4基因。作为可W具有可替代神经前体细胞的重编程中的0ct4的功能的小分子 化合物，BIX-01294是已知的（Bo Feng et al.，Cell Stem Cell 4:301,2009)，因此可W使 用此类化合物来代替导入0ct4基因。作为可W具有可替代细胞的诱导中的Klf-4的功能 的化合物，ke叩aullone是已知的化yssiotis,CA,et al.Jroc 化tl Acad Sci U S A. 2009化ne 2:106(22) :8912-8917.)，因此可W使用此类化合物来代替导入Klf-4基因。在 该说明中，为了方便起见，有时将基因和其表达产物统称为"基因"。在此类情况下，术语"导 入基卸'被术语"添加分子'、"添加药物'、"添加化合物"、"施用分子'、"施用药物"、"施用化 合物"等替代。
[004引还可W向本发明的基因组合中添加其它基因。
[0049] 本发明包括从体细胞诱导成骨细胞的方法。本发明还包括通过所述方法制备的成 骨细胞。本发明还包括用于治疗的细胞制备物，其包括成骨细胞或包含成骨细胞的移植材 料。
[0050] 当将该技术应用于体内的体细胞时，可W在体内直接产生成骨细胞。本发明还包 括该方法和用于直接诱导的制备物。
[0051] 发明的有益效果
[0052] 根据本发明的实施方案，可W通过直接重编程在短期内由体细胞提供成骨细胞。 可W由待移植的个体的体细胞容易地诱导成骨细胞。因此，即使当移植成骨细胞自身或由 细胞制备的骨组织时，也不会发生如免疫排斥反应的问题。此外，在不转化为iPS细胞或ES 细胞的情况下，可W由体细胞直接诱导成骨细胞，因此可W避免由多能干细胞导致的如致 癌作用的问题。
[0053] 附图简要说明
[0054] 图1为编码目的基因的pMXs载体的制备的图示。
[0055] 图2为实验提纲的图示。
[0056] 图3A为茜素红S染色的结果。图3A为皿的肉眼图(macrogra地）。巧化的骨基质被染 成红色，运表明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字"Γ表 示用含有各自基因的逆转录病毒载体感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒 载体感染）。
[0057] 图3B为茜素红S染色的结果。图3B为皿的肉眼图。巧化的骨基质被染成红色，运表 明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字"Γ表示用含有各自 基因的逆转录病毒载体感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染）。 [005引图3C为茜素红S染色的结果。图3C为皿的肉眼图。巧化的骨基质被染成红色，运表 明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字"Γ表示用含有各自 基因的逆转录病毒载体感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染）。
[0059] 图3D为茜素红S染色的结果。图3D为皿的肉眼图。巧化的骨基质被染成红色，运表 明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字"Γ表示用含有各自 基因的逆转录病毒载体感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染）。
[0060] 图3E为茜素红S染色的结果。图3E为皿的肉眼图。巧化的骨基质被染成红色，运表 明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字"Γ表示用含有各自 基因的逆转录病毒载体感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染）。
[0061] 图3F为茜素红S染色的结果。图3F为皿的肉眼图。巧化的骨基质被染成红色，运表 明功能性成骨细胞被诱导。对于孔的数量参见图3H(图3H的表中的数字"Γ表示用含有各自 基因的逆转录病毒载体感染，W及空白表示未用含有各自基因的逆转录病毒载体感染）。
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