高表达发酵单胞菌启动子的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物学和基因工程领域。更具体地，鉴定了用于引导细菌中嵌合基 因表达的新型启动子。
【背景技术】
[0002] 微生物的乙醇生产提供了化石燃料的替代性能源且因此成为当前研究的重要领 域。运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis)是可用于商业乙醇生产的天然产乙醇生物。然 而，运动发酵单胞菌天然情况下并不利用木糖，其为水解木质纤维素物质中主要的戊糖。人 们希望产乙醇生物利用木糖W充分利用木质纤维素生物质材料水解物中的碳水化合物底 物。
[0003] 运动发酵单胞菌和天然情况下不利用木糖的其它产乙醇生物可通过引入基因来 进行针对木糖的基因工程，所述基因编码1)木糖异构酶，其催化木糖至木酬糖的转化;2)木 酬糖激酶，其使木酬糖憐酸化W形成木酬糖-5-憐酸;3)转酬醇酶;和4)转醒醇酶。针对木糖 代谢对运动发酵单胞菌菌株的工程化化S 5,514,583，US 5,712，133，US 6,566，107，US 5， 726,053，Feldmann等人（1992)Appl Microbiol Biotechnol 38:354-361，Zhang等人 (1995)Science 267:240-243)，W及对栋桐发酵杆菌（幻mobacter palmae)菌株的工程化 (化 nase 等人（2007)Appl. Environ.Mirobiol. 73:2592-2599)已有成功。然而，工程化的菌 株在木糖上的生长W及产生乙醇通常不如葡萄糖一样良好。
[0004] 对运种工程化，已通过在运动发酵单胞菌细胞中有活性的启动子来表达编码用于 木糖代谢的异源蛋白质的基因，所述启动子通常为运动发酵单胞菌甘油醒-3-憐酸脱氨酶 基因的启动子或运动发酵单胞菌締醇酶基因的启动子。针对木糖利用进行工程化的菌株已 经通过在木糖培养基上连续传代而进行驯化，产生了具有改善的木糖利用的菌株，如US 7223575和US 7741119中所述。US 7989206和US 7998722公开了具有改善活性的运动发酵 单胞菌甘油醒-3-憐酸脱氨酶基因启动子W及其在发酵单胞菌(Zymomonas)中表达木糖异 构酶用于木糖利用的用途。
[0005] 对于另外的强启动子依然有需求，所述另外的强启动子可用于对发酵单胞菌W及 其它产乙醇生物的基因工程W表达赋予改善的木糖利用的基因。所述启动子还可用于其它 基因的表达。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了具有改善活性的合成启动子，其为运动发酵单胞菌甘油醒-3-憐酸 脱氨酶基因启动子的衍生物。
[0007] 因此，本发明提供了合成的核酸分子，其包含具有在位置90处T对C的碱基取代的 运动发酵单胞菌甘油醒-3-憐酸脱氨酶基因启动子;其中所述位置编号属于SEQ ID NO: 1。 与天然运动发酵单胞菌甘油醒-3-憐酸脱氨酶基因启动子相比，运一碱基取代具有增加所 述启动子强度的效果。
[0008] 在其它方面，本发明提供了包含合成的核酸分子的嵌合基因 W及包含其的载体， 所述合成的核酸分子具有上述碱基取代。
[0009] 在另外的方面，本发明提供了转化细菌细胞的方法，所述细菌细胞选自发酵单胞 菌细胞和发酵杆菌(Zymobacter)细胞，所述方法包括将本发明的合成核酸分子引入到所述 细胞中。
[0010] 在另一方面，本发明提供了包含本发明的合成核酸分子的重组细菌菌株，所述重 组细菌菌株选自发酵单胞菌和发酵杆菌。
[0011] 在另一个实施例中，本发明提供用于生产改善的合成甘油醒-3-憐酸脱氨酶基因 启动子的方法，该方法包括：
[0012] a)从来自发酵单胞菌和发酵杆菌的甘油醒-3-憐酸脱氨酶基因分离包含甘油醒- 3-憐酸脱氨酶基因启动子区域的核酸片段；
[0013] b)将在位置90处T对C的碱基取代引入到a)的分离片段，从而产生改善的合成甘油 醒-3-憐酸脱氨酶基因启动子。
【附图说明】 [0014] 和序列描述
[0015] 图1示出了 PZP13的质粒图谱。
[0016] 根据下面的详细描述W及构成本申请一部分的附带的序列描述可更充分地理解 本发明。
[0017] 下列序列符合37C.F.R. 1.821-1.825Γ对含核巧酸序列和/或氨基酸序列公开内 容的要求-序列规则并且符合世界知识产权组织(WIP0)标准ST.25(2009)及EP0和PCT的 序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)，W及行政性指示的208节和附录C)。用于核巧酸和氨 基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. §1.822中示出的规定。
[0018] SEQ ID N0:1为运动发酵单胞菌CP4菌株的天然ZmPgap的核巧酸序列。[4236中#1]
[0019] SEQ ID ^:2为在位置90处具有(：到1'变化的运动发酵单胞菌〔?4菌株的2111?旨曰口的 核巧酸序列。
[0020] SEQ ID N0:3为运动发酵单胞菌的ZM4菌株的天然ZmPgap的核巧酸序列。[4236中# 2]
[0021] SEQ ID ^:4为在位置90处具有(：到1'变化的运动发酵单胞菌214菌株的2111?旨曰口的 核巧酸序列。
[0022] 沈Q ID N0:5为pZB4的ZmPgap的核巧酸序列。
[0023] [4236 中 T 缺失 #3]
[0024] SEQ ID N0:6为在位置90处具有巧ljT变化的pZB4的ZmPgap的核巧酸序列。
[0025] SEQ ID ^:7为运动发酵单胞菌214菌株的2111?旨曰9的核巧酸序列，其在位置285处 具有T缺失(如在pZB4中）并且在位置90处具有C到T的变化。
[0026] 沈Q ID N0:8为l，951-bp DP1341-U片段的核巧酸序列。
[0027] 沈Q ID N0:9为l，255-bp DP1341-U片段的核巧酸序列。
[002引 SEQ ID NO: 10为GUS编码序列的核巧酸序列。
[00巧]沈Q ID N0:11为大肠杆菌化.coli)araD 3'UTR的核巧酸序列。
[0030] SEQ ID ^:12为596(3-1?表达盒的核巧酸序列。
[0031] 沈Q ID NO: 13为pZPl332的核巧酸序列。
[0032] 沈Q ID備：14为92?1337的核巧酸序列。
[0033] 沈9 10^:15为1〇义?巧片段的核巧酸序列，其位于所述596(3-1?表达盒的5/。
[0034] 沈9 10^:16为1〇义?巧片段的核巧酸序列，其位于所述596(3-1?表达盒的3/。
[0035] 包括1〇义?巧位点和限制位点的侧翼1〇义?巧序列为569 10^:15和16。
【具体实施方式】
[0036] 可使用下列定义阐释权利要求书和说明书：
[0037] 如本文所使用，术语"包含"、"包含的"、"包括"、"包括的"、"具有"、"具有的"、"含 有"或"含有的"，或者它们的任何其它变型旨在涵盖非排他性的包括。例如，包含元素列表 的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可W包括其他未明确列 出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非明确指明 相反，"或"是指包含性的"或"而非排他性的"或"。例如，条件A或B满足下列任一项:A为真实 的（或存在的）且B为虚假的（或不存在的），A为虚假的（或不存在的）且B为真实的（或存在 的），W及A和B均为真实的(或存在的）。
[0038] 此外，设及元素或组分的实例（即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词 "一个"或"一种"旨在为非限制性的。因此，应将"一个"或"一种"理解为包括一个(种)或至 少一个(种），并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
[0039] 如本文所用，术语"发邸'或"本发邸'是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的 任何单独实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施例。
[0040] 如本文所使用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语"约"是指可发生的用 数字表示的量的变化，例如:在真实世界中，通过用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和 液体处理操作;通过运些操作中非故意的误差;通过用于制备组合物或执行方法的成分的 制造、来源或纯度中的差异;等等。术语"约"还包括由于相对于由特定起始混合物所得的组 合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否由术语"约"来修饰，权利要求包括量的等同量。 在一个实施例中，术语"约"指在报告数值10 % W内，优选地在报告数值5 % W内。
[0041] 术语"木糖异构酶"是指催化D-木糖和D-木酬糖的互变的酶。木糖异构酶(XI)属于 归类为EC 5.3.1.5的酶的组。
[0042] 术语"木酬糖激酶"指憐酸化木酬糖形成木酬糖-5-憐酸的酶。
[0043] 术语"转酬醇酶"和"转醒醇酶"指戊糖憐酸化途径中的两种酶，其将木酬糖-5-憐 酸转化成连接戊糖代谢与化tner-Douderof f糖酵解途径的中间体，该途径使木糖代谢成乙 醇。
[0044] 术语"基因"指表达特定蛋白质或功能性RNA分子的核酸片段，其可任选地包括位 于编码序列之前（5/非编码序列）和之后的调控序列（3/非编码序列）。"天然基因"或"野生 型基因"指具有其自身调控序列的天然存在的基因。"嵌合基因"指不是天然基因的任何基 因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不 同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但W不同于天然存在的方式排列的 调控序列和编码序列。"内源基因"是指在生物基因组中处于其天然位置的天然基因。"外来 基因"指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，但是它通过基因转移引入到宿主生物中。 外来基因可包含插入到非天然生物内的天然基因，或