基于tem-pcr和基因芯片检测猪病毒性疾病的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于猪攝检测技术领域，尤其设及一种基于TEM-PCR和基因忍片检测猪病 毒性疾病的方法。
【背景技术】
[0002] 非洲猪攝病毒(ASFV)、猪水瘤病病毒（SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)是猪病的4种重要病原。目前我国虽无非洲猪攝发生的报道，但是，由于邻国俄罗斯多 次报道该病的发生和其可能带来的严重后果，能提早建立一种检测方法对预防该病非常必 要，且能为将来研究该病提供一定的实验基础。猪水瘤病和口蹄疫在临床表现上非常相似， 很难从临床症状将它们区别开来，所W能建立一种快速、准确检测和鉴别运两种病的方法 对将来的治疗和预后意义重大。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种基于TEM-PCR和基因忍片检测猪病毒性疾病的方法， 旨在建立一种快速、准确检测和鉴别猪水瘤病和口蹄疫的方法。
[0004] 本发明是运样实现的，一种基于TEM-PCR和基因忍片检测猪病毒性疾病的方法，所 述基于TEM-PCR和基因忍片检测猪病毒性疾病的方法依据祀序列富集多重PCR，采用4对特 异性的套式PCR引物和探针，并在各内引物的5'端分别加上能被一对通用引物识别的标签 序列，Primer Mix的浓度为0.2μΜ，反应的退火溫度为50°C。
[000引进一步，所述基于TEM-PCR和基因忍片检测猪病毒性疾病的方法包括：
[0006] DNA微阵列制备:通过原位合成法将寡核巧酸固定到基片上，采用玻片为基因忍片 的支持物，支持物，在聚合反应之前，要使表面衍生出径基或氨基；
[0007] 从细胞培养物或组织病料中提取核酸，通过PCR方法进行扩增，所有扩增产物用巧 光标记素对产物进行标记，将巧光素标记在下游引物的5 '末端；
[000引忍片的杂交；
[0009] 杂交反应过后，各阵列将带有不同浓度的巧光标记，借助激光共聚焦显微扫描仪 或CCD成像设备，根据探针标记所用的巧光素种类选择激发光波长进行扫描，然后应用数据 分析软件自动获取基因忍片上的各种信息，并对信息进行处理获得结果。
[0010] 进一步，所述PCR扩增根据ASFV P72序列、FMDV-0型序列、PRV gB序列W及SVDV序 列，通过DNAMAN比较同源性，选取保守序列。
[0011] 进一步，所述PCR扩增所用化和Ro为特异性外引物，Fi和Ri为特异性内引物，Fs和 Rs为通用引物。
[001引进一步，所述PCR扩增中基因忍片探针在祀序列区段内，设计FMDV-0型、ASFV、PRV、 SVDV的特异性探针，基因忍片探针序列及修饰方法：
[0013]每条探针的5'端均通过16个胸腺喀晚核巧酸连接有一个氨基，使用一段随机序列 作为位置质控，其5'端连接有一个氨基，3'端连接一个切3巧光基团；使用烟草花叶病毒的 一段基因作为杂交质控其5'端连接有一个切3巧光基团，并使用它的互补序列作为杂交质 控探针其5'端同样通过16个胸腺喀晚核巧酸连接有一个氨基。
[0014] 进一步，所述基因忍片探针的序列为：
[0015] ASFV NH2-T1 e-CTTGCTATTCCCTCGGTATCCATTCCCTTCGGCG
[0016] PRV NH2-TI6-CGGTCCCTGGGCTCCTCCCTCGTGAGCAACAT
[0017] FMDV-0 NH2-TI6-CCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTT
[0018] SVDV NH2-T1 6-GCAAGGCTCGCCAGGCTGGTGGTGGAAGTT
[0019] PC NH2-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-切3
[0020] HC Cy3-CGACTATAACCTTCGCTGCCGTCATTGGGTCAA [00引]PC-p NH2-T16-TTGACCCAATGACGGCAGCGAAGGTTATAGTCG。
[0022] 进一步，所述PCR扩增的反应体系：
[0023] 反应体系50]iL:2XPremix rTaq 25?Α，2μΜ Primer Mix f5yL，10yM Fs 化L，10yM Rs aiL，RNase-free dd出0 1 化L。
[0024] 进一步，所述基因忍片的杂交
[0025] 将Tem-PCR产物祉1，杂交质控（1μΜ)1μ1，2Χ样品杂交液如1置于PCR仪中，在95°C 条件下变性5min，取出置于冰上，冰浴5min;
[0026] 打开忍片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约500~1000 化超纯水;将忍片正面朝上放入杂交盒内两个定位销之间；放上忍片盖片，注意有凸台的一 面朝向忍片，上端先接触忍片，再缓缓盖下；
[0027] 然后用移液器通过盖片加样孔注入17化变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面 张力在盖片下面的凸台和忍片表面之间形成一道液膜，盖紧杂交盒盖。安装上侣合金封条， 置42°C杂交盒中避光杂交化；
[0028] 杂交后，取出忍片放在42°C预热好的洗液I中，42°C震荡清洗4min，再用42°C预热 好的洗液II，42°C震荡清洗4min，最后用42°C预热好的清水清洗一次，装于塑料玻片盒，W lOOOg/min速度离屯、干燥5min后进行扫拭忍片信息。
[0029] 本发明提供的基于TEM-PCR和基因忍片检测猪病毒性疾病的方法，与现有技术相 比，具有W下优势：
[0030] 1、本发明采用Tem-PCR(祀序列富集多重PCR,Target-Enriched Multiplex PCR) 扩增技术来扩增祀序列，克服了传统PCR方法的诸多缺点，其兼容性、特异性、灵活性等都比 传统PCR方法好得多；且本发明对Tem-PCR的反应条件作了优化，建立了一套准确高效，方便 快捷的检测方法，临床样品可在短时间内完成检测，为疾病的早期诊断和治疗提供了重要 的契机。
[0031] 2、基于Tem-PCR,用于基因忍片信号检测的巧光标记切3只需要加在通用超级引物 下游(Rs)就能实现所有待检祀序列都被加上巧光标记，降低了反应的背景噪音，且大大的 节省了实验经费。
[0032] 3、本发明首次结合了先进的Tem-PCR多重扩增技术和基因忍片检测技术，建立了 在一张忍片上可同时检测45。￥、？3￥、5￥0￥、。10￥4种病原的体系，为^后的重要病原微生物 的分子生物学检测奠定了基础。
[0033] 4、在单管反应中实现多种不同基因的高通量检测，避免了多重PCR扩增效率因多 对引物不兼容而受到影响，没有统一的反应条件，存在引物扩增偏爱性。
【附图说明】
[0034] 图1是本发明实施例提供的基于TEM-PCR和基因忍片检测猪病毒性疾病的方法流 程图。
[0035] 图2是本发明实施例提供的杂交结果图；
[0036] 图中：1 -8: PC、肥、ASFV、FMDV-0、PRV、SVDV、NC、PC。
[0037] 图3是本发明实施例提供的杂交结果；
[0038] 图中：1 -8: PC、肥、ASFV、FMDV-0、PRV、SVDV、NC、PC。
[0039] 图4是本发明实施例提供的杂交结果图；
[0040] 图中：1 -8:PC、肥、ASFV、FMDV-0、PRV、SVDV、NC、PC。
[0041] 图5是本发明实施例提供的杂交结果；
[0042] 图中：1 -8:PC、肥、ASFV、FMDV-0、PRV、SVDV、NC、PC。
【具体实施方式】
[0043] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0044] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[004引如图1所示，本发明实施例的基于TEM-PCR和基因忍片检测猪病毒性疾病的方法包 括W下步骤：
[0046] S101:DNA微阵列制备:通过原位合成法将寡核巧酸固定到基片上，采用玻片为基 因忍片的支持物，支持物，在聚合反应之前，要使表面衍生出径基或氨基；
[0047] S102:从细胞培养物或组织病料中提取核酸，通过PCR方法进行扩增，所有扩增产 物用巧光标记素对产物进行标记，将巧光素标记在下游引物的5'末端；
[004引 S103:忍片的杂交；
[0049] S104:杂交反应过后，各阵列将带有不同浓度的巧光