一种与大豆种皮颜色紧密连锁的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种与大豆种皮颜色紧密连锁的分子标记及其应用，属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 大豆[Glycine max化.）Me;r;r.]是世界上广泛种植的豆类作物，蕴涵丰富的蛋白 质，含有人体自身不能合成的八种必需氨基酸，对人类营养非常重要。大豆种子油分和蛋白 含量分别在20%和40%左右，是植物脂肪和饲料蛋白的重要来源。在大豆种质资源分类及 遗传育种中，种皮颜色一直作为大豆资源分类的重要依据，并且是育种后代评估的重要形 态标记。栽培大豆是从黑种皮的野生大豆进化演变而来，具有黄、绿、黑、褐、双等丰富的种 皮颜色。大豆种皮色与大豆种子外观W及商品质量关系密切，其导致种皮颜色差异的自然 产物包括类黄酬和花青素，不仅影响到抗氧化性的药用价值和营养价值，还在抗低溫胁迫 或减少病毒疾病方面具有一定的效果。因此，大豆种皮色的研究不仅具有重要的理论意义， 而且具有实用价值。
[0003] 大豆种皮色的遗传研究始于20世纪初，迄今已发现至少有6个位点（I，T，W1，R，0， G)参与控制性状的形成(Yang et al. 2010; Wang et al. 2013)，同时位点间存在互作，遗传 基础复杂(Gai et al.2006)Dl，R，T运3个位点主要通过控制色素的合成调控种皮的颜色 (Bernard et al. 1973;化Imer et al.l987;Nicholas et al. 1993)。1 位点控制花青素和 原花青素的空间分布位置与沉积，抑制整个种皮的色素沉积，从而导致成熟种皮表现为均 匀的黄色。I位点被定位在大豆第8号染色体一个富含查尔酬合成酶(CHS)的区域(Todd et al.l996;Clou曲et al.2004;Tuteja et al.2004)。!?和Τ两个位点通过控制原花青素和花 青素的种类控制局部具体颜色(Zabala et al.2003;Toda et al.2002)，包括黑色（i，R， T)、不完全黑（i，R，t)、褐（i，r，T)和浅褐（i，r，t)(化ngetal.2010)。黑色种皮（i，R，T)和 不完全黑色种皮（i，R，t)中花青素和原花青素均有沉积(Buzzetl et al.l987;Todd et al.l993)。褐（i，r，T)、浅褐（i，r，t)种皮中只有原花青素合成(Zabala et al.2003)。其余 两个位点0和W1只是在纯合隐性的i r和i t基因型中格自影响种皮颜色（Bernard et al. 1973)，它们可能编码类黄酬代谢途径相关酶及转运酶或者相关的调控因子(Yang et al.2010；Zabala et al.2007；Xie et al.2003)〇
[0004] 随着分子标记技术的出现和发展，通过关联分析和连锁分析已在多种植物中定位 了与产量、品质、抗性等农艺性状相关的QTL(Huang,et al.2012;Liu et al.2007;Qi et al.2014;Park et al.2012;化mri et al.2010)。国内外在大豆种皮颜色基因定位和连锁 标记筛选方面开展了很多工作，除了经典遗传学定位的位点之外，人们利用分离群体在5个 连锁群上定位了8个大豆种皮颜色相关的QTUGithiri et al.2007;0yoo et al.2010; OhnisM et al.2011)，但是由于标记数量较少，定位的区间一般比较大。在运些QTL中，有 两个QTL与I位点比较近，但是由于定位区间较大，很难确定他们就是一个QTL。近年来也有 一些报道将多个位点的标记结合起来可W增加对大豆种皮颜色的选择效率(Guo and Qiu 2013;Li et al.2014a)。
[000引上述多数研究表明，大豆种皮颜色是由多基因控制的复杂形状，不同的基因之间 存在着相互调控关系，同时，大豆作为一种古四倍体植物，基因组重复序列较多，遗传定位 群体普遍较小，运些因素都增加了大豆种皮颜色基因精细定位和分离的难度。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测待测大豆种皮颜色性状的引物。
[0007] 本发明提供的检测或辅助检测待测大豆种皮颜色性状的引物为如下1)-4):
[000引1)由引物对1、引物对2、引物对3和引物对4组成的成套引物：
[0009] 2)引物对 1;
[0010 ] 3)由引物如和引物对2组成的成套引物；
[0011 ] 4)由引物如、引物对巧P引物对4组成的成套引物；
[001引所述引物如为由序列1所示的单链DM分子和序列2所示的单链DNA分子组成； [001引所述引物对2为由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成； [0014]所述引物对3为由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成；
[001引所述引物对4为由序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子组成。
[0016] 本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测大豆种皮颜色性状的PC时式 剂。
[0017] 本发明提供的检测或辅助检测待测大豆种皮颜色性状的PC时式剂包括上述引物。
[0018] 上述PC时式剂中，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3和所述引物对4在所述 PCR试剂中的终浓度均为0.2皿ol/L。
[0019] 本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测大豆种皮颜色性状的试剂 盒。
[0020] 本发明提供的检测或辅助检测待测大豆种皮颜色性状的试剂盒包括上述引物或 上述PCR试剂。
[0021] 本发明还有一个目的是提供上述引物或上述PC时式剂或上述试剂盒的新用途。
[0022] 本发明提供了上述引物或上述PC时式剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测大豆 种皮颜色性状中的应用。
[0023] 本发明还提供了上述引物或上述PC时式剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待 测大豆种皮颜色性状的产品中的应用。
[0024] 上述引物或上述PC时式剂或上述试剂盒或上述应用中，所述大豆种皮颜色性状为 绿色、黄色、黑色或褐色。
[0025] 本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测大豆种皮颜色性状的方 法。
[0026] 本发明提供的检测或辅助检测待测大豆种皮颜色性状的方法为如下(A)-(D):
[0027] (A)包括如下步骤：
[0028] A1)用上述引物对1对待测大豆的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0029] A2)检测所述PCR扩增产物的大小，
[0030] 若引物对1对应的PCR扩增产物大小为224bp，则待测大豆种皮颜色为或候选为绿 色或黄色；
[0031 ]若引物对1对应的PCR扩增产物大小为186bp，则待测大豆种皮颜色为或候选为黑 色或褐色；
[0032] B)包括如下步骤：
[0033] B1)分别用上述引物对1和引物对2对待测大豆的基因组DNA进行PCR扩增，得到巧中 PCR扩增产物；
[0034] B2)检巧獅述巧中PCR扩增产物的大小，
[003引若引物对1对应的PCR扩增产物大小为224bp，且引物对2对应的PCR扩增产物大小 为258bp，则待测大豆种皮颜色为或候选为绿色；
[0036] 若引物对1对应的PCR扩增产物大小为224bp，且引物对2对应的PCR扩增产物大小 为27化P，则待测大豆种皮颜色为或候选为黄色；
[0037] C)包括如下步骤：
[003引 C1)分别用上述引物对1、引物对3和引物对4对待测大豆的基因组DNA进行PCR扩 增，得到巧巾PCR扩增产物；
[0039] C2)检巧獅述巧中PCR扩增产物的大小，
[0040] 若引物对1对应的PCR扩增产物大小为186bp，且引物对3对应的PCR扩增产物大小 为288bp，且引物对4对应的PCR扩增产物大小为30化P，则待测大豆种皮颜色为或候选为黑 色；
[0041 ] 若引物对1对应的PCR扩增产物大小为186bp，且引物对3对应的PCR扩增产物大小 为248bp，且引物对4对应的PCR扩增产物大小为30化P，
[0042] 或引物对1对应的PCR扩增产物大小为186bp，且引物对3对应的PCR扩增产物大小 为248bp或288bp，且引物对4对应的PCR扩增产物大小为294bp，则待测大豆种皮颜色为或候 选为褐色；
[0043] D)包括如下步骤：
[0044] D1)分别用上述引物对1、引物对2、引物对3和引物对4对待测大豆的基因组DNA进 行PCR扩增，得到4种PCR扩增产物；
[004引 D2)检测所述4种PCR扩增产物的大小，
[0046] 若引物对1对应的PCR扩增产物大小为224bp，且引物对2对应的PCR扩增产物大小 为258bp，且引物对3对应的PCR扩增产物大小为248bp或288bp，且引物对4对应的PCR扩增产 物大小为294bp或30化P，则待测大豆种皮颜色为或候选为绿色；
[0047] 若引物对1对应的PCR扩增产物大小为224bp，且引物对2对应的PCR扩增产物大小 为27化P，且引物对3对应的PCR扩增产物大小为248bp或288bp，且引物对4对应的PCR扩增产 物大小为294bp或30化P，则待测大豆种皮颜色为或候选为黄色；
[0048] 若引物对1对应的PCR扩增产物大小为186bp，且引物对2对应的PCR扩增产物大小 为258bp或27化P，且引物对3对应的PCR扩增产物大小为288bp，且引物对4对应的PCR扩增产 物大小为30化P，则待测大豆种皮颜色为或候选为黑色；
[0049] 若引物对1对应的PCR扩增产物大小为186bp，且引物对2对应的PCR扩增产物大小 为258bp或27化P，且引物对3对应的PCR扩增产物大小为248bp，且引物对4对应的PCR扩增产 物大小为300bp;或引物对1对应的PCR扩增产物大小为18化P，且引物对2对应的PCR扩增产