新的综合性耳聋相关基因突变检测体系及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ]本发明设及生物学研究和Waardenburg综合征的分子检测领域，具体设及一种新 的综合性耳聋相关基因突变检测体系及试剂盒。
【背景技术】
[0002] Waardenburg综合征(Waardenburg Syn化ome，WS)，是最常见的染色体显性和隐性 遗传性综合征型耳聋，又称听力-色素综合征，主要的临床特征为感音神经性耳聋W及虹 膜、头发和皮肤的色素分布异常，根据不同的伴随表型又分为4型。WS的人群发病率为1/ 212000,但由于该综合征的不完全外显率达20%，故推测实际人群发病率为1/42000,占先 天性耳聋的2~5%，聋哑人群中发病率为0.9~2.8%。据目前研究表明，WS具有高度的遗传 异质性，已证实与WS有关的基因有6个，分别为:Μ 口F、PAX3、SOX 10、SNA 12、ENDRB、EDN3，已报 道WS基因突变位点有近278个。关于WS的拷贝数变异(Copy number variation,CNV)国外已 有报道，Mil un sky、Wildhardt G利用多重连接依赖探针扩增（Multiplex li gat ion- dependent probe amplif ication，MLPA) 分别发现了WS 相关基因上 PAX3 和 MITF 的多个 CNV， 提高了 WS的突变检出率，并一致认为，相关基因的CNV检测应作为一种常规检测方法应用到 WS的分子诊断检测中。
[0003] 目前针对目标基因 CNV的检测方法有W下几种：FISH、多重可扩增探针杂交 (Multiplex amplifiable probe hyb;ridization，MAPH).、多重连接依赖探针扩增 (Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)、实时巧光定量PCR(Rea]_- time quantitative PCR)、短巧光片段多重定量PCR(Quantitative multiplex PCR of short fluorescent fra卵ents，QMPSF)、C細 Array。除FI細和CGH外，W上运些方法都W PCR为基础，适用于对特定目标基因进行定量分析。在筛查和诊断遗传性疾病上，运些方法 存在各自的优缺点。
[0004] 基于多重可扩增探针杂交的MAPH方法是Armour等人于2000年报导的一种用于基 因拷贝数变异的定量分析方法。该方法把特定的PCR产物与固定在尼龙膜上基因组DNA进行 杂交，通过PCR及电泳技术检测杂交回收探针的量，来实现基因组中相应目的DNA片段拷贝 数的检巧U。相比较下面要介绍的MLPA技术，MAPH与MLPA均可W同时检测40多个目的序列，结 果的准确度、精度高。但是，该方法的步骤繁琐，需要先固定样本DNA及洗脱未反应的探针， 难W满足临床诊断的需要。
[0005] MLPA是Schouten等人于2002年首先报导的，该方法可W检测出DNA序列的缺失和 重复。该方法特异、高效，一次反应可W同时检测40多个目的序列拷贝数的改变，但存在W 下几方面不足:1、检测平台开放式，容易造成污染;2、其设计的长探针不能通过化学方法合 成，需要通过M13载体克隆的方法获得;3、杂交步骤耗时过长（16小时）。运些都是MLPA不可 避免的局限性。
[0006] 短巧光片段多重定量PCR最早应用于染色体非整倍体的产前基因诊断。运项技术 的方法原理是，首先选取目的基因外显子上的一段短片段序列，用标记了巧光的引物同时 对多个短片段进行扩增，然后将扩增的产物进行毛细管电泳分析，根据图谱中产物峰的长 度和面积计算待测位点的拷贝数。目前已成为临床应用得较为成熟的一项技术。该方法的 优点是准确性高，无需细胞培养，诊断可在一天内完成。它的不足之处在于多个短片段存在 于一个体系中进行多重PCR，增加了设计的难度。
[0007] 实时巧光定量PCR，是目前临床诊断系统广泛应用的检测平台之一。因为它具备了 传统PCR的优点，同时又克服了传统PCR的许多缺点。首先，操作简便，快速高效，具有很高的 敏感性和特异性;其次，是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，有效的避免污染，而 且直接检测结果，无需扩增后操作;另外，多巧光通道允许在同一反应体系中同时对多个目 的序列进行扩增。该方法广泛应用于针对特定位点进行拷贝数定量，对已知的CNV进行确 认。但是多重PCR本身存在一些问题。不同引物对之间的错配扩增，不同勒序列扩增效率不 一致导致效率低的祀点被扩增效率较高的祀点所抑制，运些都会影响拷贝数定量分析。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术存在的W上问题，提供一种新的综合性耳聋相关 基因突变检测体系及试剂盒，筛选出59个Waardenburg综合征相关基因检测位点，并且结合 多重PCR和毛细管电泳等技术设计专用检测探针，组合成一个高效准确快速的检测体系，实 现在该体系内对6个WaardenbiKTg综合征相关基因的拷贝数变异的同时快速检测。
[0009] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过W下技术方案实现：
[0010] -种新的综合性耳聋相关基因突变检测体系，针对目前已知的6个与Waardenbu;rg 综合征相关的基因，选取的59个检测位点组成耳聋基因突变检测体系，采用连接酶连接反 应的高特异性对目的区域进行杂交、连接，然后通过在连接探针末段引入不同长度的非特 异序列W及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，利用标记巧光的通用 引物对连接产物进行PCR扩增，通过巧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，最后通过对 电泳图谱的分析获取各个位点的峰高，其中：
[001。 1)共设计了 91对多重PCR引物，91对引物中包括59对检测探针和32对参照探针;针 对每个位点设计2条探针：1条5 '端探针和1条3 '端探针，其5 '端探针序列由巧光集团，正向 通用引物序列和位点5'侧特异性序列组成，3'端探针序列由位点3'侧特异性序列、位点鉴 别连接序列、3'端通用引物序列组成;所述的5'端探针序列如SEQ ID NO.: 1至SEQ ID NO.: 91所示，所述的3'端探针序列如沈Q ID NO. :92至沈Q ID NO. :182所示；
[0012] 2)将高溫处理后的短片段基因组DNA与探针混合物变性复性，各探针与对应模板 进行配对；
[0013] 3)加入连接酶反应体系，配对在同一模板上的紧邻探针在连接酶作用下进行特异 性连接，产生连接产物；
[0014] 4)利用带巧光标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增，不同长度的扩增产物利 用巧光毛细管电泳获得分离；
[0015] 5)通过对巧光毛细管电泳数据文件中不同长度的连接产物峰谱的分析确定不同 位点的峰高；
[0016] 6)多重位点分型的实现:通过改变位点鉴别序连接序列的长度来获取不同连接长 度的连接产物，实现多个位点的检测;通过改变探针中通用引物序列，随后采用不同巧光标 记的通用PCR引物进行扩增从而进一步增加检测位点的数目，所述通用PCR引物序列如SEQ ID NO. :183至沈Q ID NO. :188所示。
[0017] 进一步的，所述的多重PCR引物Tm在64-66°C，PCR产物长度在170bp之内。
[0018] -种新的综合性耳聋相关基因突变检测试剂盒，包括：
[0019] 4址NA裂解缓冲液，
[0020] lOx连接酶缓冲液，
[0021 ] 连接酶，
[0022] 探针混合液，
[0023] d地 2〇，
[0024] 2xPCR反应混合液，
[002引 PCR引物混合液。
[0026] 进一步的，所述探针混合液序列如沈Q ID NO. :1至沈Q ID NO. : 182所示。
[0027] 进一步的，所述PCR引物混合液序列如沈Q ID NO. : 183至沈Q ID NO. : 188所示。
[0028] 本发明的有益效果是：
[0029] 本发明的优越性在于通过对现有多重核酸分子扩增技术加 W改进，设计特定的检 测探针，设置特定的检测体系组分和反应条件，W同时对6个已知与Waardenburg综合征有 关的基因上的共59个位点进行快速拷贝数变异检测，市面尚无专口针对Waardenburg综合 征相关拷贝数变异进行检测的技术和产品，检测可在一个工作日内完成，最低仅需200纳克 的DNA即可得到准确的检测结果。
[0030] 1.该检测试剂盒选取的6个基因是利用最新报道的Waardenburg综合征相关基因 突变信息和湘雅医院耳鼻咽喉科在临床检测中积累的第一手资料进行筛选得到，覆盖了已 知明确与Waardenbu;rg综合征致病相关的所有基因，相比目前市面已有的Waardenburg综合 征检测产品，本试剂盒覆盖了更多的致病基因，提高了检出率。
[0031 ] 2.市面尚无专口对Waardenburg综合征进行拷贝数变异检测的试剂盒。本试剂盒 同时对6个Waardenburg综合征相关基因的56个检测位点进行检测，覆盖所有基因的各个外 显子和上游调控序列，目前还没有Waardenburg综合征的检测试剂盒可实现运样的检测分 辨率。
[0032] 3.通过对检测探针序列、反应条件、反应体系和检测流程进行设计和优化，使该试 剂盒能更准确、更高效的对59个检测位点同时进行拷贝数变异检测，只需200纳克的DNA样 本即可进行检测，可在一个反应体系内进行，24小时内完成，提高了检测人员的工作效率。
[0033] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予W实施，W下W本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。 本发明的【具体实施方式】由W下实施例及其附图详细给出。
【附图说明】
[0034] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： [003引图1为本发明反应流程示意图；
[0036] 图2为MITF_promoter2_0探针巧光信号示意图；
[0037] 图3为MITF_promoterl_0探针巧光信号示意图 [003引图4为MITF_E01_0探针巧光信号示意图。
【具体实施方式】
[0039] 下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
[0040] 本技术是针对目前已知的6个与Waardenburg综合征相关的基因，选取的59个检测 位点组成耳聋基因突变检测体系。该技术基本原理是基于专利申请人前期已申请的《多重 核酸分析》创新技术（中国专利申请号201280001947.3)，采用连接酶连接反应的高特异性 对目的区域进行杂交、连接，然后通过在连接探针末段引入不同长度的非特异序列W及通 过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，利用标记巧光的通用引物对连接产 物进行PCR扩增，通过巧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，最后通过对电泳图谱的分 析获取各个位点的峰高。具体流程见附图1:
[0041] 1)针对每个位点设计2条探针：1条5'端探针和1条3'端探针，其5'端探针序列由巧 光集团，正向通用引物序列和位点5'侧特异性序列组成，3'端探针序列由位点3'侧