基于微生物发酵的n-乙酰-d-氨基葡萄糖的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设医药加工工艺技术领域，尤其设及一种基于微生物发酵的N-乙酷-D-氨 基葡萄糖的制备方法。
【背景技术】
[0002] N-乙酷-D-氨基葡萄糖，英文名称N-Acetylglucosamine，分子结构式为：
[0003]
[0004] 化学名称:2-(乙酷氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖。
[000引 N-乙酷-D-氨基葡萄糖是一种较高甜度的还原性单糖，在生物体内具有许多重要 的生理功能，临床上是治疗风湿性及类风湿性关节炎的药物，亦作为食品抗氧化剂、婴幼儿 食品添加剂和糖尿病患者的甜味剂W及用于化妆品，在生命科学、医学和精细化工领域有 极其重要的意义。
[0006] 目前生产N-乙酷-D-氨基葡萄糖主要有两种工艺，一种工艺是邮蟹壳经酸脱巧，碱 脱脂和蛋白质而加工成甲壳素，再由甲壳素经盐酸酸解成D-氨基葡萄糖盐酸盐，然后再由 D-氨基葡萄糖盐酸盐加醋酢乙酷化反应而制得，但是工艺中有易制毒化学品醋酢，有毒品 扩散的风险，甲壳素的原料是邮蟹壳，其供应易受季节变化而受到影响。另一种工艺是甲壳 素通过甲壳素酶的作用制得N-乙酷-D-氨基葡萄糖，但甲壳素酶价格昂贵，使得生产成本太 高而难W实现工业化，且现有工艺在纯化过程中浓缩时溫度较高，容易使产品部分氧化变 性而使产品得率降低和含量下降。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术所存在的缺陷，提供一种基于微生物发酵的N-乙 酷-D-氨基葡萄糖的制备方法，利用可再生资源，能实现大规模工业化生产，降低了生产成 本，在除蛋白工序中，加入壳聚糖进行絮凝，使得在发酵工艺中难W去除的小分子蛋白质及 氨基酸得到了有效的去除，在浓缩时通过加入酒精降低了溶液的沸点，从而最大限度地保 护产品不被氧化变性。
[000引为实现上述目的，本发明提供了一种基于微生物发酵的N-乙酷-D-氨基葡萄糖的 制备方法，包括：
[0009] 将保藏工程菌种的甘油管置于常溫下融化形成混合液;所述工程菌种为产N-乙 酷-D-氨基葡萄糖代谢短杆菌；
[0010] 用接种环薩取所述混合液涂布于含有链霉素和安普霉素的平板或斜面，37°C培养 18~24小时，完成菌种活化；
[0011]挑取活化后得到的工程菌单菌落于装液量lOml LB的Ξ角瓶中，37°C振荡培养8小 时，得到一级种子;所述Ξ角瓶为50ml或者100ml，所述Ξ角瓶中还包括链霉素50mg/L和安 普霉素50mg/l;
[001引将101111-级种子接种于装液量1L二级种子培养基的化摇瓶中，34°C振荡培养16~ 20小时，00600 = 2~4,并4~5瓶，接入3000L种子罐中，得到二级种子;所述二级种子培养基 包括：含量为14g/L的K此P04,0.02g/L的CaCl2,21g/L的K此P04 · 3出0，lg/L的巧樣酸钢· 2此0，7.5g/L的硫酸锭，0.25g/L的MgS04 · 7此0，20g/L的葡萄糖和0.1 ml/L的1000倍微量元 素母液;所述摇瓶中还包括50mg/L的链霉素和50mg/L的安普霉素；
[0013] 在种子罐中加入链霉素50mg/L，揽拌;其中，揽拌转速为22化pm，通风比1:0.8;
[0014] 在3000化发酵罐中将发酵培养基进行灭菌，并加入灭菌后的葡萄糖，截止后体积 为21000升，加氨水调抑至6.9，再将所述二级种子接种于所述3000化发酵罐中发酵；
[001引 37°C，揽拌速度0~150转/分钟，溶氧保持在20 % W上，用氨水控制抑在6.9，通风 比 1:0.5，罐压：0.051口曰；
[0016] 当葡萄糖耗完后，W2g/L.h的速度补加葡萄糖，保持比生长速率为0.3~0.6;
[0017] 检测0D600，当00600 = 10± 1，W6.5g/L.h的速度补加650g/L的葡萄糖母液；
[0018] 当0D600 = 25±1时，加入诱导剂开始诱导；所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖巧 IPTG，终浓度为0.2mM;
[0019] 37°C培养，其中，葡萄糖浓度保持在5g/L~lOg/l;
[0020] 监测发酵罐溶氧，待溶氧开始下降后，减慢补加葡萄糖的速度，使葡萄糖浓度至 5g/LW下，直至溶氧为0;
[0021] 待溶氧回升至30%~50%，控制添加葡萄糖速度W使发酵液中葡萄糖浓度保持在 3g/L~5g/L;
[0022] 每隔4小时取样一次，检测N-乙酷-D-氨基葡萄糖的含量，至含量增加量为小于 0.5 %时，停止发酵，得到所述N-乙酷-D-氨基葡萄糖的发酵液；
[0023] 将所述发酵液进行经65°C1小时灭菌，经陶瓷膜或板框过滤去除菌体，并水洗滤出 的菌体浓缩液，至所述菌体浓缩液中N-乙酷-D-氨基葡萄糖含量低于2%;
[0024] 加入1 %的305活性炭室溫揽拌30~60分钟脱色后过滤；
[0025] 加入0.3%~2%的无机酸和/或有机酸至滤液中，揽拌均匀；
[0026] 向揽拌均匀的滤液中加入壳聚糖或壳聚糖的溶液，使加入后料液中的壳聚糖所占 比例为0.2%~2%;
[0027] 再向料液中加入5%~30%无机碱液和/或有机碱，将料液的pH调至7.8~8.2，使 壳聚糖完全絮凝析出，静置0.5~2小时；
[0028] 经抽滤或离屯、，将滤液抽入胆存罐中；
[0029] 滤液经离子交换混床后，在滤液中加入5%~30%的无水酒精，揽拌均匀，经50°C ~60°C减压浓缩至有晶体析出时，静置12小时；
[0030] 将析出的结晶物料移入过滤槽进行抽滤或移入离屯、机进行离屯、，得白色固体物 料；
[0031] 将白色固体物料移入漂洗槽中，加入浓度在95% W上的酒精进行漂洗，然后再进 行离屯、；
[0032] 将再次离屯、后的物料移入真空干燥箱中，60°C~70°C真空干燥，得白色结晶粉末， 即为制备得到的N-乙酷-D-氨基葡萄糖。
[0033] 优选的，在所述将保藏工程菌种的甘油管置于常溫下融化形成混合液之前还包 括：
[0034] 挑取抗性平板上生长的工程菌单菌落，加入抗性LB培养基中形成菌液，于37°C培 养8~12小时；
[0035] 向培养好的菌液中加入1/2体积的50%灭菌甘油混匀，分装至无菌的保菌管里，每 管1ml，置于-80°C保藏;其中，加入后的甘油终浓度为16.7%。
[0036] 优选的，在所述将保藏工程菌种的甘油管置于常溫下融化形成混合液之前还包 括:挑取抗性平板上生长的工程菌单菌落，加入抗性LB培养基中形成菌液，于37°C培养8~ 12小时；
[0037] 向培养好的菌液中加入1/2体积的50%灭菌甘油混匀，分装至无菌的保菌管里，每 管1ml，置于-20°C保藏，并每半年至少活化一次;其中，加入后的甘油终浓度为16.7%。
[0038] 优选的，所述工程菌单菌落为产N-乙酷-D-氨基葡萄糖代谢短杆菌；
[0039] 所述加入抗性LB培养基中形成菌液的培养时间为9~10小时。
[0040] 优选的，所述滤液经离子交换混床后，在滤液中加入无水酒精，加入的量所占总比 例为10%~25%。
[0041 ]优选的，所述34°C振荡培养的时间为16~19小时。
[0042] 优选的，在所述将发酵培养基移入3000化发酵罐中进行灭菌之前，所述方法还包 括：
[0043] 按照初始体积21000升的量加入含量为6.67旨/1的1(出?〇4,3.55旨/1的一水巧樣酸， 0.025g/L的CaCl2 ·此0,0.25g/L的消泡剂，2.5g/L的MgS〇4 · 7此0,5g/L的葡萄糖和Iml/L的 1000倍微量元素，配制发酵培养基。
[0044] 优选的，所述将所述二级种子接种于所述发酵罐中，37°C进行揽拌的揽拌速度具 体为10~100转/分钟。
[0045] 优选的，所述无机酸包括:盐酸、硝酸、憐酸或硫酸中的任意一种或多种的组合;所 述有机酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、下酸、乳酸、马来酸、巧樣酸、酒石酸或班巧酸中的任意一 种或多种的组合。
[0046] 优选的，所述无机碱液包括:氨氧化钢溶液、氨氧化钟溶液、碳酸钢溶液、碳酸钟溶 液、碳酸氨钢溶液、碳酸氨钟溶液或氨水中的任意一种或多种的组合;所述有机碱包括：乙 醇钢、甲胺、乙胺、乙醇胺、乙二胺、二甲胺、Ξ甲胺、Ξ乙胺、丙胺、异丙胺、Ξ乙醇胺、1,3-丙 二胺、1,2-丙二胺或Ξ丙胺中的任意一种或多种的组合。
[0047] 本发明实施例提供的基于微生物发酵的N-乙酷-D-氨基葡萄糖的制备方法，先将 经过特殊保存的工程菌种进行两级培养，然后将发酵培养基移入发酵罐中，同时加入灭菌 后的葡萄糖，再将二级培养的种子接种于发酵罐中，严格控制发酵参数直至发酵充分，然后 将过滤后的发酵液进行脱色、加壳聚糖絮凝除蛋白、过滤和加酒精浓缩结晶，最后洗涂、烘 干得到N-乙酷-D-氨基葡萄糖。生产利用了可再生资源，价格便宜，也不受季节性因素的影 响，采用无毒的天然高分子材料壳聚糖作絮凝剂，不仅可有效去除小分子蛋白质和氨基酸， 还可W吸附和馨合重金属，有效提高了产品的含量，降低了产品中的杂质。浓缩结晶中加入 一定量的酒精，降低了待浓缩液体的沸点，从而降低了结晶时的溫度，使N-乙酷-D-氨基葡 萄糖与氧气的接触减少，进而最大限度地保护了 N-乙酷-D-氨基葡萄糖不被氧化变色，降低 了产品产生其他杂质的概率。
【附图说明】
[0048] 图1为本发明实施例提供的基于微生物发酵的N-乙酷-D-氨基葡萄糖的制备方法 流程图。
【具体实施方式】
[0049] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述