粗甘油与木质纤维素水解液共转化生产微生物油脂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于产油微生物的培养技术领域，尤其设及一种粗甘油与木质纤维素水解 液共转化生产微生物油脂的方法。
【背景技术】
[0002] 自然界中某些微生物在特定条件下，能够W碳水化合物、碳氨化合物、二氧化碳等 为碳源，在体内合成并胆存大量油脂，凡是可W在胞内积累油脂并超过细胞干重20%(w/w， 运里w/w表示质量比，下同）的微生物称为产油微生物。某些产油微生物胞内积累的油脂甚 至超过其细胞干重的70%。微生物油脂，尤其是产油真菌产生的油脂，其主要成份是甘油Ξ 醋，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，WC14-C22长链脂肪酸为主。相对于动植物油 月旨，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源， 易于实现规模生产，是极具潜力的新型油脂资源。微生物油脂不仅可W作为食用油或其他 功能性油脂的替代品，还可W为生物柴油产业可持续发展提供原料。
[0003] 培养基中缺乏产油微生物生长繁殖的必要成分或培养条件时，比如培养基中缺乏 氮、憐、硫、铁、锋和溶氧等时，产油微生物生长繁殖被限制，会诱导油脂积累。通过氮限制实 现产油微生物油脂积累是最常用的策略。油脂发酵过程中，随着氮源被耗尽，产油酵母生长 受到抑制，碳水化合物主要导向油脂积累。然而，由于微生物油脂是胞内产物，合成大量的 油脂，需要足够量的菌体。因此，当营养极其丰富时，碳水化合物不会导向油脂合成，当营养 过度匿乏，菌体数量受到限制，均不利于油脂的大量生产。
[0004] 2014年全球生物柴油生产量达到3000万吨，其生产过程中的副产物粗甘油超过 300万吨，已经超过了市场的需求。虽然甘油是很多精细化工中必不可少的平台化合物，但 粗甘油中存在着大量的酸、碱、无机盐、甲醇、有机酸、甚至一些重金属，不能够被直接应用 于化学工业，而且纯化成本非常高。在一些国家和地区，粗甘油甚至被当做废水直接处理 掉，不仅造成了资源的浪费，也引发了环境的污染。近年来，将生物柴油产业的副产物粗甘 油转化为微生物油脂，作为生物柴油的原料，成为了研究热点。然而，由于粗甘油中氮源极 度匿乏，导致菌体几乎不增殖，过少的菌体也不利于油脂的大量生产。目前主要通过添加适 量的氮源营养，如酵母粉、蛋白腺、玉米浆W及其它富氮组分等，使产油微生物适量增殖，从 而大量合成油脂。
[0005] 木质纤维素材料来源广泛、是自然界中最丰富的可再生资源之一，全球年产高达 1500亿吨，其化学成份主要是纤维素、半纤维素和木质素。纤维素完全水解主要产物为葡萄 糖;半纤维素水解可得到木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等的混合物。利用木质纤 维素水解液培养产油微生物，有可能大幅度降低原料成本，并使规模化制备微生物油脂的 原材料得到保障。然而，木质纤维素原料通常氮含量高，另外其降解过程中添加水解酶，也 会引入一定量的氮源，导致水解液中C/^比很低，产油微生物W菌体增殖为主，油脂产量和 油脂得率非常低，当前利用木质纤维素水解液培养产油微生物存在油脂产量低的突出问 题。
[0006] 因此目前产油微生物方法中，在粗甘油中添加氮源营养额外增加了成本;而木质 纤维素水解液的脱氮除憐则不仅增加了工艺流程，还会造成碳水化合物的损失。W上两种 原料各自用于微生物油脂生产时，所需成本均较高。为了充分利用粗甘油和木质纤维素资 源，需要找到一种更简单、经济的方法，显著提高油脂产量和得率，提高微生物油脂的技术 经济性。
【发明内容】
[0007] 鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种粗甘油与木质纤维素水解液共转化生 产微生物油脂的方法，旨在解决现有方法成本过高的技术问题。
[0008] 在培养基中，过高或者过低的C/^比均不利于产油微生物积累油脂。粗甘油中由于 氮源极度匿乏导致C/^比过高，而木质纤维素水解液中氮源丰富导致C/^比过低，两者分别 作为原料独立培养产油微生物时，油脂产量均很低，本发明提出一种粗甘油与木质纤维素 水解液共转化生产微生物油脂的方法，具体包括如下步骤：
[0009] 预处理木质纤维素，按照2%-20%(w/w)的固液比，并添加适量的木质纤维素降解 酶进行降解反应，得到木质纤维素水解液，所述水解液中包含有由木质纤维素降解得的可 发酵性生物质糖；
[0010] 将粗甘油与所述木质纤维素水解液按比例混合，得到产油微生物培养基，将产油 微生物培养基的pH值调整为4.0-9.0，然后灭菌备用;其中所述粗甘油所含碳源占总碳源质 量的20%-90%，所述生物质糖所含碳源占总碳源质量的10%-80%，控制C/N比为35-400;
[0011] 取产油微生物并在种子培养基中培养，得到产油微生物种子液；
[0012] 将所述产油微生物种子液接种至所述产油微生物培养基中，接种量为2%-20% (v/v，体积比，下同，即种子液体积占产油微生物培养基体积的2%-20%)，于20°C-37°C通 气培养，直至发酵液中残余甘油和糖的浓度低于5g/L，终止发酵，固液分离收集产油微生物 菌体。
[0013] 必要时，还可W在产油微生物培养添加一些营养物质，比如占产油微生物培养基 总质量0.01 %-2%的氮源、占产油微生物培养基总质量0.01 %-2%的憐源、占产油微生物 培养基总质量0.01 %-1 %的硫源、占产油微生物培养基总质量0.001 % W内的维生素，任取 其一或者它们之间的任意组合。
[0014] 本发明的有益效果是：由于粗甘油中氮源极度匿乏，C/N比过高，木质纤维素水解 液中氮源丰富，C/N比过低，两者分别作为原料培养产油微生物时，油脂产量均很低。本发明 提供了一种培养产油微生物的新的方法，将粗甘油和木质纤维素水解液混合，使碳源中粗 甘油中的碳源占碳源总量的20%-90 %，木质纤维素中的碳源占碳源总量的10%-80%，合 理调整C/^比至35-400,使得甘油和碳水化合物均彻底转化且主要导向油脂合成，从而实现 油脂的大量的积累；方法极其简单，显著提高了原料的转化率和微生物油脂生产的技术经 济性，具有广阔应用前景;该方法获得的产油微生物具体含有一种或多种脂肪酸及其衍生 物，可用于制备生物柴油或其他高附加值产品；与粗甘油和木质纤维素水解液分别作为原 料制备微生物油脂技术相比，本发明同时转化利用粗甘油和木质纤维素制备微生物油脂， 可节约设备及占地成本，具有非常好的应用前景。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下实施例对本发明进行 进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定 本发明。
[0016] 本发明通过将粗甘油和木质纤维素混合调配，使混合物的C/^比适中，运样原料中 的甘油和碳水化合物均可彻底利用且主要导向油脂合成，从而实现油脂的大量的积累。方 法极其简单，从而避免了两者各自作为原料油脂发酵过程中粗甘油中额外添加氮源营养， W及木质纤维素水解液的脱氮和/或除憐，大大降低了原料成本和过程操作成本，具有明显 的综合技术优势。
[0017] 本发明方法具体包括如下步骤：
[0018] 步骤S101、预处理木质纤维素，按照2%-20%(w/w)的固液比，并添加适量的木质 纤维素降解酶进行降解反应，得到木质纤维素水解液，所述水解液中包含有由木质纤维素 降解得的可发酵性生物质糖。
[0019] 本步骤采用常用的物理、化学、物理化学或生物的方法预处理木质纤维素，按照 2%-20%(w/w)的固液比，添加适量的木质纤维素降解酶，将预处理的木质纤维素中的纤维 素和半纤维素降解成可发酵性生物质糖，包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘 露糖、纤维寡糖、木寡糖、半乳糖醒酸等。
[0020] 本发明所适用的木质纤维素为主要成份为纤维素、半纤维素和木质素的生物质材 料。包括玉米賴杆、玉米忍、稻草、稻壳和麦杆等农业生物质，树木、枝权和银末等林业生物 质，甘薦渣、甜菜渣和甜高梁渣等工业生物质，水葫芦和碑子等杂草，柳枝稷和芒草等能源 植物中的一种或二种W上组合。所述木质纤维素降解酶为具有降低碳水化合物聚合物的聚 合度的酶，包括纤维素酶、β-葡萄糖巧酶、木聚糖酶、β-木糖巧酶、果胶酶等的一种或它们的 组合。
[0021] 步骤S102、将粗甘油与所述木质纤维素水解液按比例混合，得到产油微生物培养 基，将产油微生物培养基的抑值调整为4.0-9.0,然后灭菌备用；其中所述粗甘油所含碳源 占总碳源质量的20 %-90 %，所述生物质糖所含碳源占总碳源质量的10%-80%，控制C/^比 为35-400。
[0022] 本步骤将粗甘油与所述木质纤维素水解液按比例混合，制备产油微生物培养基。 所述粗甘油为各种动植物油脂(如动物油、屠宰场含油下脚料、大豆油、玉米油、藍麻油、菜 巧油、栋桐油等），地沟油和微生物油脂等与短链醇经醋化或转醋化工艺制备生物柴油过程 的副产物，主要成分为甘油水溶液，还含有一定量的酸、碱、甲醇和无机盐等杂质。在产油微 生物培养基中不添加或添加少量营养物质，包括氮源、憐源、硫源和维生素，如酵母粉、蛋白 腺、锭盐、硫酸盐、憐酸盐、硫胺素等或它们的组合，其中氮源占产油微生物培养基总质量的 0.01 %-2%、憐源占产油微生物培养基总质量的0.01 %-2%、硫源占产油微生物培养基总 质量的〇.〇1%-1%、维生素占产油微生物培养基总质量的0.001%?内。
[0023] 在选择粗甘油与所述木质纤维素水解液的混配比例时，粗甘油所含碳源占总碳源 质量的20%-90 %，所述生物质糖所含碳源占总碳源质量的10%-80%，使得混合液中C/^比 为35-400,运样甘油和碳水化合物均彻底利用且主要导向油脂合成，从而实现油脂的大量 积累。
[0024] 然后调整产油微生物培养基pH为4.0-9.0之间，然后灭菌备用。
[0025] 步骤S103、取产油微生物并在种子培养基中培养，得到产油微生物种子液。
[00%]所述产油微生物为经发酵后菌体油脂含量可超过细胞干重20 %的真核微生物，它 们包括但不限于下列之一：油脂酵母(如斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi)、红酵母(如圆 红冬抱酵母加〇(1〇39〇1'1(1；[加11：01'11101(163、粘红酵母加0(101：01'1113肖1111：；[]113和掷抱酵母 Sporobolo