基因重组杆状病毒的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其设及一种TGEV S2基因重组杆状病毒的构建 方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胃肠炎（Porcine transmiss;Lble gastroenteritis,TGE)是由猪传染性 胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种W严重 腹泻、呕吐和脱水为临床症状的高度传染性疾病，主要侵害2周龄W内的仔猪，死亡率高达 100%，各阶段的猪都易感，给养猪业造成了不可估量的损失。五、六十年代该病开始在我国 有相关报道，近年来我国各个地方时有该病发生。当前还没有特别有效的药物来医治该病， 主要依靠接种疫苗来进行防控。TGEV主要是通过消化道粘膜和呼吸道粘膜感染易感猪群， 可见肠道粘膜免疫诱导的SIgA能够有效抵御TGEV感染。因此，研究一种有效刺激机体免疫 系统产生粘膜免疫应答的新型疫苗，对TGE的防治具有重要意义。TGEV S蛋白具有主要的B 淋己细胞抗原决定簇，唯一诱导机体产生中和抗体并提供免疫保护作用的;且S蛋白含有宿 主细胞氨肤酶受体(pAPN)的识别位点。因此在研究TGEV基因工程疫苗时将S基因作为首选 祀基因。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种TGEV S2基因重组杆状病毒的构建方法及其应用，旨 在W杆状病毒为载体，表达TGEV主要抗原表位基因 S2，将重组杆状病毒口服和肌注免疫小 鼠，检测小鼠粪便中的sIgA和血清中的IgG水平，试验结果初步证明重组杆状病毒可诱导 小鼠产生粘膜免疫和体液免疫应答。
[0004] 本发明是运样实现的，一种TGEV S2基因重组杆状病毒的构建方法，所述TGEV S2基 因重组杆状病毒的构建方法包括：
[0005] S2基因的扩增，用TGEV感染ST细胞，37°C培养4她，反复冻融，10000巧m/min离屯、 lOmin，收集上清，利用RNAiso plus方法提取病毒总RNA，按照体系进行扩增；
[0006] 重组转移载体的构建，将回收的S2基因和炸as巧ac?Dual质粒经EcoR巧日Sail双酶 切后连接，S2基因定向克隆于pFastBac?Dual的化启动子下游，构建重组转移载体 pFastBac?Dual-S2,转化D册日，经PCR鉴定，将初步鉴定为阳性的质粒进行测序，用DNAstar 软件分析插入片段的正确性；
[0007] 重组Bacmid质粒的构建与鉴定，取扣L重组供体质粒pFas巧ac?Dual-S2,将其转入 E.coliDHlOBac感受态细胞，在含卡那霉素（50μg/ml)、庆大霉素（化g/ml)、四环素（1化邑/ ml)、X-gal (100μg/ml)和IPTG(40μg/ml)的LB琼脂培养基上，37°C避光培养48h，挑取白色较 大的单个菌落，培养过夜，按照化reLink? fliF>ure Plasmid DNA化rification Kits的操 作手册提取穿梭质粒DNA，经PCR鉴定后，将阳性重组穿梭载体命名为Bacmid-S2,用于转染 S巧细胞；
[000引重组杆状病毒的获得及鉴定，将鉴定为阳性的Bacmid-S2利用CellfectinR π Reagent转染sf 9昆虫细胞，27°C，5 % C02培养箱培养直至出现病变，收获细胞上清，进行PCR 鉴定，将上清液在sf 9昆虫细胞盲传3代，重组病毒命名为巧acmid-S2;
[0009] SDS-PAGE检测，分别用巧acmid-S2P3代毒、野生杆状病毒P3代毒感染Sf9细胞，27 °C，5%C02培养箱培养72h，反复冻融，10000巧m/min离屯、约lOmin，分别收集上清液和沉 淀，配制分离胶和浓缩胶。
[0010] 进一步，所述TGEV S2基因重组杆状病毒的构建方法选择一对M13通用引物：
[0011] S2上游引物:5 ' -ACTGAATTCATG TCATTGAACACAACGGGT-3 '，其5 ' 端斜体下划线部分 设计有EcoRI酶切位点；
[0012] S2下游引物：5 '-CGTGTCGACTAAGCCACTAAGTAGCGTCCT-3 '，其5 ' 端斜体下划线部分 设计有Sail酶切位点；
[0013] 113上游引物:5'-〔0：461^4〔64〔6176了4444〔6-3'；
[0014]
[0015] 进一步，按照W下体系进行扩增：RT:MgCl2 化U10XRT Buffer 化L、RNase Free 出0 1.75yL、dNTP Mixture lyL、RNase Inhibitor 0.25yL、AMV Reverse Transcriptase 0.扣L、Random 9mers化L、RNA模板化L、TGEV S2下游引物0.扣L。反应条件为30°C10min，42 °C30min，95°C5min，5°C5min;
[0016] PCR反应体系：上、下游引物各0.化UTaKaRa Ex Taq HS 0.5^、5ΧΡ〔Κ Buffer lOyL、模板化L，用dd 出0补至50化，反应条件为94°C3min，94°C30s，55°C30s，72°Clmin30s， 30个循环；72°C延伸lOmin，扩增产物与克隆载体pMDlS-T连接，WpMD18-T-S2质粒为模板， 扩增S2基因，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0017] 进一步，配制分离胶和浓缩胶的方法如下：
[001引分别取上清及沉淀于离屯、管中，按比例加入5 X SDS Loading Buffer，混匀煮沸 lOmin后，瞬时离屯、，制成蛋白样品，小屯、拔去梳子，组装好电泳装置；
[0019]在样品槽中各加入20化样品，加样完毕后，连接电泳仪，先将电流巧制在8mA，20 ~30min;当漠酪蓝指示剂到达分离胶之后，将电流调至16mA，保持电流稳定；
[0020] 当漠酪蓝指示剂迁移至前沿时即可停止电泳，1~化，电泳结束后，取胶，使用 0.25 %的考马斯亮蓝染液染色30min，弃去染色液，用蒸馈水漂洗数次，加入脱色液进行脱 色过夜，期间更换脱色液，直至蛋白质带清晰为止，观察对比条带，利用凝胶成像系统拍照。
[0021] 本发明的另一目的在于提供一种所述TGEV S2基因重组杆状病毒的构建方法的 TGEV S2基因重组杆状病毒在诱导机体免疫中的应用。
[0022] 本发明提供的TGEV S2基因重组杆状病毒的构建方法及其应用，利用杆状病毒表 达系统表达TGEV S2基因，获得重组杆状病毒，将其经肌肉、口服免疫小鼠，分别于免疫前与 免疫后14、28、42d收集小鼠粪便和血清，ELISA方法检测粪便中抗TGEV sIgA和血清中抗 TGEV sIgG水平，结果显示，口服组28d，sIgA抗体水平最高，之后随着时间延长抗体水平逐 渐下降。口服组和肌注组42d，血清中抗TGEV sIgG仍维持较高水平。实验结果证实了重组 TGEV S2基因的杆状病毒可诱导小鼠产生粘膜免疫和体液免疫应答，为研究新型TGEV基因 疫苗探索了新途径。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明实施例提供的TGEV S2基因重组杆状病毒的构建方法流程图。
[0024] 图2是本发明实施例提供的S2基因扩增片段电泳图；
[0025] 图中：M.DL6000 DNA Marker;1.S2基因 PCR产物。
[0026] 图3是本发明实施例提供的S2基因扩增片段电泳图；
[0027] 图中：M.DL6000 DNA Marker;1.S2基因 PCR产物。
[002引图4是本发明实施例提供的组穿梭质粒Bacmid-S2的PCR鉴定示意图；
[0029] 图中：M.DL6000 DNA 1日浊6';1.]?13片段口0?产物。
[0030] 图5是本发明实施例提供的巧acmid-S2蛋白质电泳示意图；
[0031] 图中：Μ:蛋白Marker; 1:野生杆状病毒细胞沉淀；2:野生杆状病毒细胞上清；3:正 常细胞沉淀；4:正常细胞上清；5: rBacmid-S2细胞沉淀；6: rBacmi d-S2细胞上清。
[0032] 图6是本发明实施例提供的重组杆状病毒rBacmid-S2免疫小鼠粪便特异性抗体 IgA示意图。
[0033] 图7是本发明实施例提供的重组杆状病毒rBacmid-S2免疫小鼠血清特异性抗体 IgG示意图。
【具体实施方式】
[0034] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0035] 本发明利用杆状病毒表达系统表达TGEV S2基因，获得重组杆状病毒，将其经肌 肉、口服免疫小鼠，检测重组杆状病毒诱导小鼠机体产生体液免疫和粘膜免疫应答效果，为 新型TGEV基因疫苗探索了新途径。
[0036] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0037] 如图1所示，本发明实施例的