一种醇脱氢酶lc3及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物工程技术领域，更具体地设及一种醇脱氨酶LC3及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 酬还原酶广泛存在于高等动、植物W及低等微生物体内。酬还原酶在催化酬、醇时 表现出高度的化学、区域、对映体选择性，受到颇多学者的青睐，现成为生物催化领域不可 或缺的催化剂。
[0003] 醇脱氨酶(ADH)家族来源的酶在手性化合物合成中占据了重要地位。醇脱氨酶对 醒基、酬基、单糖W及酬类固醇具有氧化还原能力。醇脱氨酶可分为锋离子依赖性的ADH和 非离子依赖性的ADH(短链醇脱氨酶)两个超家族。目前研究最多的是短链醇脱氨酶家族。酬 还原酶，作为氧化还原酶系中的一个分支，W还原型烟酷胺腺嚷岭二核巧酸(NADH)或烟酷 胺腺嚷岭二核巧憐酸(NADPH)为辅酶，可在溫和的条件下将一系列酬或者醒不对称还原为 具有光学活性的手性醇。
[0004] 手性药物是指引入手性的药物有的一对互为镜像关系的对映异构体，它们的理化 性质相似，但是立体结构的旋光性有所差异。可分为外消旋、R型（右旋）和S型（左旋)Ξ种。 不同的对映体对于不同的目标具有不同的生物活性，一个异构体是有效的，可能另一个是 无效甚至有害的。手性药物的用量低、药效好的特点在临床治疗方面展现出了良好的应用 前景。近年来，随着对药物手性特征的深入研究W及对光学异构体的认识度的提高，手性药 物的市场迅猛增长，而消旋药物的市场W每年29.5%的速度递减。如今市场上销售药品的 Ξ分之一都为单一的同分异构型，即手性药物进行销售。而目前开发的药物Ξ分之二都是 手性药物。
[0005] 手性醇一般可通过天然物质提取、化学合成和生物合成方法获得。(R)/(S)-4-氯- 3-径基下酸乙醋(C皿E)是一种非常重要的合成许多药物化合物的手性中间体。化学合成法 催化产物的能耗高、污染高，相对于生物法有很多缺陷。生物法又分为动力学拆分异构体和 底物不对称还原制备光学纯的CHBE。外消旋体的拆分虽然简单易行，但是其制备效率不高， 且所得产物为混合物，后期分离困难。
[0006] 生物催化转化法制备手性化合物是W氧化还原酶及其相关的微生物作为催化剂 催化还原潜手性的底物幾基，生成相应的手性醇。其中利用基因工程菌进行全细胞催化已 成为生物催化生成手性CHBE的发展趋势，生物催化法在制备高对映体过量的手性化合物方 面具有效率高、成本低、装置简单、对环境污染小等优势，近年来受到广泛关注。具有良好的 工业化前景。
[0007] 现已发现的能够催化4-氯乙酷乙酸乙醋(C0BE)生成光学醇的4-氯-3-径基下酸乙 醋(C皿E)的氧化还原酶中大都为生成(S)-C皿E的酶，生成(R)-CHBE的酶比较少见而且转化 率比较低。现报道的单水相催化C0BE中最高浓度能够达到800mM，24h完全转化生成（R)- CH邸(ee〉99%)。（R)-C皿E可用于合成レ肉毒碱、大环内醋A、阿法替尼、2,5-环己二締合成 纤维的关键手性中间体，并且能够转化为[+ ]负霉素。阿法替尼是一种口服药物，是表皮生 长因子受体化GFR)和人表皮受体2化ER2)酪氨酸激酶的不可逆抑制剂，用于EGFR外显子19 缺失和外显子化85R)取代突变的转移性非小细胞肺癌患者的一线治疗。阿法替尼 (a化t in i b)由德国勃林格殷翰研发，已于2013年7月获美国FDA批准上市。目前阿法替尼的 合成路线还是主要W化学合成法来进行。所W生物催化转化法制备(R)-CH邸具有良好的应 用价值。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种醇脱氨酶LC3及其基因和应用，从而解决现有技术中制 备手性醇的生物酶的缺失。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0010] 根据本发明的一个方面，提供一种醇脱氨酶LC3,其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所 /J、- 〇
[00川所述醇脱氨酶LC3来源于CCTCC Μ 2011381雷氏乳酸杆菌化actobacillus curieae sp.Nov.)。
[0012] 虽然GenBank上公布了一种双乙酷还原酶，并且具有与上述沈Q ID N0:2相同的氨 基酸序列，也就是说，该段序列在此之前被认为是一种双乙酷还原酶。但是，所谓双乙酷还 原酶，主要用于催化还原联二酬，而醇脱氨酶属于酬还原酶的一种，催化还原的是酬基，本 专利利用醇脱氨酶催化还原的是一种酬基。醇脱氨酶来源有很多，但针对该底物进行催化 还原需要进行大量的筛选试验探索。本领域技术人员一般不会从双乙酷还原酶推断出其可 W用来催化还原酬类，因此，目前对于双乙酷还原酶还停留在催化还原联二酬上。
[0013] 根据本发明的另一方面，提供一种醇脱氨酶基因 lc3,其碱基序列如SEQ ID N0:1 所示。
[0014] 还提供一种重组质粒，所述重组质粒由所述醇脱氨酶基因 lc3与表达载体质粒连 接构建而成。
[0015] 优选地，该表达载体质粒为祀T-28a，构成重组质粒lc3-pET-28a。
[0016] 还提供另一种重组质粒，所述重组质粒由如上所述的醇脱氨酶基因 lc3W及葡萄 糖脱氨酶基因 gdh与表达载体质粒连接构建而成。
[0017] 优选地，该表达载体质粒为祀T-28a，构成重组质粒lc3-g化-pET-28a。
[0018] 根据本发明的又一方面，提供一种表达醇脱氨酶LC3的基因工程菌株，所述基因工 程菌株是将包括醇脱氨酶基因 lc3的重组质粒转化宿主菌获得的基因工程菌株。
[0019] 根据本发明的又一方面，提供一种共表达醇脱氨酶LC3和葡萄糖脱氨酶GDH的基因 工程菌株，所述基因工程菌株是将包括醇脱氨酶基因 lc3W及葡萄糖脱氨酶基因 gdh的重组 质粒转化宿主菌获得的基因工程菌株。
[0020] 该葡萄糖脱氨酶基因 GDH含有783bp碱基，其在Genbank中的收录号为M12276,由该 基因编码的幾基还原酶，包含260个氨基酸，其在Genbank中的收录号为AAA22463。
[0021 ] 本发明从雷氏乳酸杆菌(Xactobacillus curieae sp.Nov.)中提取了醇脱氨酶基 因 lc3,并构建了含有醇脱氨酶基因 lc3的基因工程菌株，从而实现了该醇脱氨酶基因 lc3的 异源表达，所产生的醇脱氨酶LC3具有优良的酶学特性，催化还原的溫度范围为25-50°C，催 化还原pH值为5.0-8.0，在40°C条件下保存2地后还有70 % W上的的残余酶活。
[0022] 所述醇脱氨酶LC3的催化溫度优选为30-40°C，pH优选为5.0-7.0。
[0023] 所述醇脱氨酶LC3的催化溫度最优选为35°C，抑最优选为6.0。
[0024] 目前本领域对于双乙酷还原酶的研究还仅限于催化还原二碳基，尤其是联二酬， 如2,3-下二酬，因此，根据本领域公知常识，双乙酷还原酶并不能被用来催化4-氯乙酷乙酸 乙醋生成(R)-4-氯-3?基下酸乙醋。
[0025] 而本发明还提供一种所述醇脱氨酶LC3W及所述基因工程菌株在合成手性醇类产 品中的应用。
[0026] 特别是所述醇脱氨酶LC3W及所述基因工程菌株被用于催化4-氯乙酷乙酸乙醋生 成(R)-4-氯-3?基下酸乙醋的应用。
[0027] 具体地，本发明还提供了一种将共表达醇脱氨酶LC3和葡萄糖脱氨酶GDH的基因工 程菌株用于催化4-氯乙酷乙酸乙醋生成(R)-4-氯-3?基下酸乙醋的应用，该应用包括:将 共表达醇脱氨酶LC3和葡萄糖脱氨酶GDH的基因工程菌株培养所得菌体作为催化剂，在W下 反应体系中进行催化反应：pH 5.0~8.0憐酸盐、LC3-GDH湿菌体、1.5M~2.25M葡萄糖、 0.2mM NA护、1.0M~1.5M C0邸于30~45°C水浴锅中，揽拌，反应结束，反应液用乙酸乙醋萃 取，收集萃取相，离屯、，取有机相减压蒸馈回收乙酸乙醋，得到油状的液体即为(R)-4-氯-3 径基下酸乙醋的粗品。
[00%]虽然现有技术将该氨基酸序列编码的蛋白定义为一种双乙酷还原酶，但是根据本 领域公知常识，双乙酷还原酶主要用于催化还原联二酬，并不用于催化还原酬基，本发明首 次发现由该序列编码的蛋白也是一种醇脱氨酶，并惊奇地发现可将其用于催化4-氯乙酷乙 酸乙醋生成重要的手性中间体(R)-4-氯-3?基下酸乙醋。因此，本发明将由该段序列编码 的蛋白作为一种醇脱氨酶LC3应用于生物酶法合成手性醇4-氯-3?基下酸乙醋和其他手性 醇类产品的生产中相对现有技术均具有创造性。其中，基于氧化还原反应，在高底物(C0肥） 浓度条件下，在单水相中该醇脱氨酶LC3就已实现高浓度催化合成(R)-CHBE的反应。本发明 的生物催化法单水相制备手性醇(R)-4-氯-3?基下酸乙醋，产量高达1.46M/L(243.2g/L)。 在此基础上，本发明还成功构建了含有葡萄糖脱氨酶g化基因和醇脱氨酶lc3基因共表达的 质粒W及含有该重组质粒的共表达基因工程菌株。与双菌禪合催化合成手性(R)-CH肥相 比，该共表达基因工程菌具有反应速率快、方便、底物浓度高的特点。
【附图说明】
[0029] 图1是本发明纯化的醇脱氨酶LC3的SDS-PAGE图，其中，Μ为蛋白Marker，1为