一种复合菌剂及其在烟叶醇化中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种复合菌剂及其在烟叶醇化中的应用，属于烟叶增香处理技术领 域。
【背景技术】
[0002] 在烟叶醇化发酵阶段，增加特定的微生物可有效缩短烟叶醇化发酵时间、调控烟 叶中主要化学成分的含量（降低烟叶烟碱含量、降低烟叶蛋白质、降低氨基酸含量、降低 TSNA)、增加烟叶香气前体物含量。
[0003] 很多研究结果表明，通过改进烟叶微生物发酵条件或者加入多种物质，可明显提 高烟叶内在品质，降低烟叶杂气和刺激性。如Seaaich等报道在卷烟前6天喷洒链格抱的抱 子悬浮液可大大提高烟叶的香气。Wentiligy等研究发现，某些酵母菌菌株接种醇化烟叶 上，3天后可诱发烟叶产生诱人的香气。赵铭钦等研究发现，用微生物处理烟叶后，明显改善 烟叶香气质量，杂气及刺激性减小。CN104207324A公开了一种保藏号CCTCC M2013150为枯 草芽抱杆菌，将其接种于烟叶并进行发酵，结果显示可提高烟叶致香物质的含量。但上述方 法改善效果有限。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提出一种复合菌剂W及其在烟叶醇化中的应用。将复合菌剂用于 烟叶醇化中，可提高烟叶香气物质含量，改善烟叶醇化品质，为开发具有独特风格特色烟叶 打下基础。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种复合菌剂，由枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、解淀粉酶芽抱杆菌混合而成；其 中，枯草芽抱杆菌的活菌数不小于109c化/ml，地衣芽抱杆菌的活菌数不小于109c化/ml，解 淀粉酶芽抱杆菌的活菌数不小于109C化/ml。
[0007] 其中，所述枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌均分离自茅台酒曲；其中，所述枯草芽抱 杆菌经鉴定为枯草芽抱杆菌MTLBOUBacillus subtilis MTLB01)，保藏编号为CCTCC N0:M 2015575,保藏日期为2015年9月25日，保藏于中国典型培养物保藏中屯、（简称CCTCC，地址： 中国武汉武汉大学，邮编:430072);
[000引所述地衣芽抱杆菌经鉴定为地衣芽抱杆菌MTLB02(Bacillus licheniformis MTLB02)，保藏编号为CCTCC N0:M 2015576,保藏日期为2015年9月25日，保藏于中国典型培 养物保藏中屯、(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，邮编:430072)。
[0009] 本发明所述解淀粉酶芽抱杆菌则选择本领域技术人员所理解的常规解淀粉酶芽 抱杆菌即可，如市售购买或自行培养所得。
[0010] 作为本发明优选的实施方式，所述复合菌剂中，枯草芽抱杆菌的活菌数109cfu/ ml，地衣芽抱杆菌的活菌数109c化/ml，解淀粉酶芽抱杆菌的活菌数109c化/ml。
[0011] 本发明所述的复合菌剂中，所述枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌的获取步骤如下：
[0012] 1)将茅台酒曲黑色部分接种于PDA平板培养基中，于48-50°C培养23-24h，挑取其 中单菌落进行常规纯化培养；
[0013] 2)将纯化菌液接种于小麦培养基中，按照37°C，46°C，55°C的溫度梯度培养6d;其 中，37°C培养2天，46°C培养2天，55°C培养2天；
[0014] 3)从步骤2)培养得到的混合菌株中筛选出产酱香香味物质较多的枯草芽抱杆菌、 地衣芽抱杆菌。
[0015] 其中，所述PDA培养基配制方法为：称取200g马铃馨，洗净去皮切碎，加 lOOOmL d地2〇煮沸30min，四层纱布过滤，加20g葡萄糖，15-20g琼脂，充分溶解，121°C灭菌30min后 倒平板，冷却备用。
[0016] 所述小麦培养基配方为:将小麦破碎成麦粒和麦粉各半共lOOg，加50 %水，121°C 灭菌30min，冷却打散备用。
[0017] 本发明还提供了上述复合菌剂的制备方法，将枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、解淀 粉酶芽抱杆菌分别接种于PDA培养基中，于36-37°C培养22-24h，收集菌液，按比例混合即 可。
[0018] 本发明还提供上述复合菌剂在烟叶醇化发酵过程中的应用。
[0019] 本发明还提供一种烟叶醇化处理方法，将复合菌剂喷洒于烟叶表面进行醇化发酵 处理。其中，喷洒量为1%，即ImL菌液/kg烟叶；醇化发酵条件为:溫度38-40°C，时间23-25 天。
[0020] 本发明将茅台酒致香微生物的功能开发与提高烟草质量联系起来，首次将茅台酒 曲微生物发酵产物应用于烟叶发酵中，通过运些致香微生物的活动或其代谢产物的添加， 可增加烟叶发酵中优质微生物的种类，增加香味物质的种类，起到类似添加茅台酒增香的 效果，从而提高烟叶醇化质量。
【附图说明】
[0021 ]图1为不同发酵时间致香物质总量图。
[0022] 图2为不同发酵时间新植二締含量图。
[0023] 图3为不同发酵时间巨豆Ξ締酬含量图。
[0024] 图4为不同发酵时间二氨雜猴桃内醋含量图。
[0025] 图5为不同发酵时间茄酬含量图。
[0026] 图6为不同发酵时间β-胡萝h素降解产物含量图。
[0027] 图7为不同发酵时间叶黄素降解产物含量图。
[0028] 图8为不同发酵时间挥发性酬类含量图。
[0029] 图9为不同发酵时间半挥发性酬类含量图。
[0030] 图10为不同发酵时间挥发性醒类含量图。
[0031] 图11为不同发酵时间直链脂肪酸醋类含量图。
[0032] 图12为不同发酵时间杂环类含量图。
[0033] 图13为不同发酵时间挥发性醇类含量图。
[0034] 图14为不同发酵时间直链脂肪酸含量图。
【具体实施方式】
[0035] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0036] 实施例1复合菌剂的制备
[0037] 1.1培养基的制备
[003引 1)PDA液体培养基的制备：即称取200g马铃馨，洗净去皮切碎，加水lOOOmL d地20 煮沸30min，四层纱布过滤，加20g葡萄糖，充分溶解，121°C灭菌30min冷却备用。
[0039] 2)小麦培养基的制备:将小麦破碎成麦粒和麦粉各半共lOOg，加50%水，121°C灭 菌30min，冷却打散备用。
[0040] 1.2复合菌剂的制备
[0041] 1)枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌的分离
[0042] 将茅台酒曲黑色部分接种于PDA平板培养基中，于50°C培养2地，挑取其中单菌落 进行纯化培养，将由此分离的纯化菌株菌液加入小麦培养基中，按照37°C，46°C，55°C的溫 度梯度培养6d，其中，37°C培养2天，46°C培养2天，55°C培养2天;从培养得到的混合菌株中 筛选出产生较多酱香香味物质的菌株(即枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌)作为产香菌株。
[0043] 其中，所述枯草芽抱杆菌的保藏菌号：CCTCC Μ 2015575,所述地衣芽抱杆菌的保 藏菌号：CCTCC Μ 2015576。
[0044] 2)复合菌剂的制备
[0045] 将枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌和解淀粉酶芽抱杆菌分别接种于PDA培养基中，于 37°C培养2地，收集菌液，再按活菌数109cf u/ml、109cf u/ml、109cf u/ml混合，即得复合菌剂。
[0046] 实施例2烟叶的醇化发酵处理
[0047] 选取贵州省駭西南地区A3C2(中部叶)进行试验，先采用同时蒸馈萃取法对烟叶预 处理，将上述实施例1制得的复合菌剂W接种量l%(lmL菌液/kg烟叶）喷洒于烟叶上，在溫 度4