一株来自白花丹参植物内生真菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物技术领域，尤其设及一株来自白花丹参植物内生真菌及其应 用。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素是地球上最为丰富的可再生生物质资源。我国木质纤维素类资源非常 丰富，賴杆、稻草、甘薦渣、动物粪便等农业废弃物中含有大量的纤维素和木质素，但是运些 资源并没有被合理利用，而是被焚烧或者被随意丢弃。随着环境污染、能源亏缺、人口膨胀 等问题日趋严重，可作为一种潜在的可再生资源被加 W利用，因此，国内外学者对木质纤维 素降解微生物进行了大量研究，但运些微生物处理后纤维素的降解率仍然不高，主要原因 是木质素的侧链与半纤维素 W共价键结合，形成一个十分致密的网络结构，阻碍了微生物 对纤维素的降解。因此，要提高木质纤维素利用率，最好的方法是先降解木质素，其中漆酶 是快速检测木质素分解程度的重要指标，而后再对纤维素、半纤维素进行彻底降解。因此， 本专利的目的是寻找能高效降解木质素和纤维素的微生物菌株，用于提高賴杆等木质纤维 素的利用率。
[0003] 植物内生真菌(Plant endophytic化ngi)是指那些在其生活史的一定阶段或全 部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌。内生真菌在长期与植物共 生的过程中，与木质纤维紧密接触，具有较高的纤维素酶、漆酶、果胶酶、木聚糖酶W及多酪 氧化酶活性，对木质素和纤维素有很好的降解能力，为筛选木质纤维素降解菌提供了一个 良好的菌种来源。目前采用单一菌株发酵生产选木质纤维素复合降解酶报道的较少，且现 有菌种所产的复合酶酶活较低，组成酶系也较单一，不能满足需要生产的需要。至今尚未见 从白花丹参内生真菌中筛选复合酶高产菌株的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一株来自白花丹参植物内生真菌及其 应用，该菌株在产酶培养基中，产生丰富的木质纤维素复合降解酶。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一株来自白花丹参植物内生真菌，其为白黄小脆柄茹（Psathyrella candolleana)抓F15,已于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中屯、(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No. 11415。
[0007] 一种菌剂，其活性成分为上述的白黄小脆柄茹（Psathyrella candolleana) 抓 FI 5。
[000引优选:上述菌剂为下述(1)-(4)任一菌剂：
[0009] (1)用于制备木质素纤维素复合降解酶的菌剂；
[0010] (2)用于降解木质素和纤维素的菌剂；
[0011] (3)用于提高农业废弃物利用率的菌剂；
[0012] (4)用于提取中草药或其废弃物有效成分的菌剂。
[0013] 所述白黄小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15在制备下述（1)-(4)任一菌 剂中的应用：
[0014] (1)用于制备木质素纤维素复合降解酶的菌剂；
[0015] (2)用于降解木质素和纤维素的菌剂；
[0016] (3)用于提高农业废弃物利用率的菌剂；
[0017] (4)用于提取中草药或其废弃物有效成分的菌剂。
[0018] 优选:所述农业废弃物为賴杆、稻草、甘薦渣或动物粪便。
[0019] 优选:所述中草药为丹参。
[0020] 上述白黄小脆柄茹（Psathyrel la candol leana)BDFl 5或W白黄小脆柄茹 (Psathyrella candolleana)BDF15为活性成分的菌剂在制备木质素纤维素复合降解酶中 的应用。
[0021 ] 上述白黄小脆柄茹（Psathyrel la candol leana)BDFl 5或W白黄小脆柄茹 (Psathyrella candolleana)BDF15为活性成分的菌剂制备在木质素纤维素复合降解酶时 所用的发酵培养基为:各成分的浓度比为:葡萄糖:教皮:牛肉膏:K出P〇4:MgS〇4 · 7出0:硫酸 铜= 20:20:5:3:1.5:0.2。
[0022] 优选:培养溫度为28±rC。
[0023] 优选:摇瓶培养5~6天。
[0024] 本发明所述的白黄小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15的固体培养为马 铃馨综合培养基：马铃馨200g，麦教50g，葡萄糖20g，M gSOa . Og，蛋白陈5. Og，琼脂20g，水 加至1000血，自然抑。培养条件:28± rC培养3~4天，菌落直径32~36mm，7-9天长满整个培 养皿;菌丝白色，拉状，不易挑取;菌落干燥，不透明，与培养基结合紧密。
[00巧]本发明所述的白黄小脆柄茹(Psathyrella candolleana)抓F15,其产酶筛选培养 基（即产纤维素酶培养基）组成为:簇甲基纤维素钢(CMC-Na)20g，蛋白腺lOg，酵母粉5g， 化C15g，K此P〇4 1. Og，MgS〇4.7此0 0.2g，琼脂20g，蒸馈水lOOOmL，自然pH。产漆酶培养基： PDA-愈创木酪(0.04 % )培养基。
[00%] 本发明所述的白黄小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15的产酶发酵培养 基组成为:葡萄糖20g，教皮20g，牛肉膏5.0g，K出P〇4 3.0g，MgS〇4 · 7出0 1.5g，硫酸铜0.2邑， 加水至ΙΟΟΟιΛ;摇瓶培养5~6天，培养溫度28±rc;发酵培养特征:培养第1天，未见明显生 长现象，培养第2天，有菌丝球出现，4天后培养液中白色菌球数量增多，直径变大;培养第5- 6天，菌丝球数量达到最大量，到了 7~9天，菌丝球集结，发酵液颜色变黄。
[0027] 菌株抓F15在产酶培养基中，28±rC振荡培养5~6d后，产生丰富的木质纤维素复 合降解酶，该复合酶包括纤维素降解酶(FPA，CM化se，Cl酶，β-葡萄糖巧酶）、木质素降解酶 漆酶W及果胶酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶等辅助酶。酶活力分别为：FPA 53.26U/mL， CMCase 73.35U/mL，Cl酶52.22U/mL，e-葡萄糖巧酶68.2洲/mL，漆酶452.84U/mL，果胶酶 13.4抓/mL、木聚糖酶27.2 lU/mL、蛋白酶45.52U/mL、淀粉酶12.54U/mL，发酵液经8层纱布过 滤后，500化· min-i离屯、5min，取上清液即为复合酶粗制剂。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] 实验证明，本发明是从白花丹参根样品中经过层层筛选，最终筛选出了白黄小脆 柄茹(Psathyrella candolleana)抓F15,该菌株能够产生木质素纤维素复合降解酶，提高 了木质素的降解效率，降低了成本。
[0030] 本发明筛选的菌株制备的复合酶的方法具有酶系完整、酶活性高、操作简单、成本 低廉等优点，为制备复合酶提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性， 具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产。
[0031] 保藏说明
[0032] 菌种名称：白黄小脆柄茹
[0033] 拉下名：（Psathyrella candolleana)
[0034] 菌株编号:BDF15
[0035] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、
[0036] 保藏机构简称:CGMCC
[0037] 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号 [003引保藏日期：2015年11月4日
[0039] 保藏中屯、登记入册编号:CGMCC No. 11415
【附图说明】
[0040] 图1为白黄小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15在马铃馨综合培养基上的 生长特征；
[0041 ] 图2为白黄小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15在PDA-愈创木酪平板上的 产漆酶情况，其中，A. BDF15培养3加寸产生的漆酶氧化圈（正面）；B. BDF15培养3加寸产生的漆 酶氧化圈（背面）；C.BDF15培养5加寸产生的漆酶氧化圈（正面）；D.BDF15培养5加寸产生的漆 酶氧化圈（背面）；
[0042] 图3为白黄小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15在液体产酶培养中的生长 状况。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 马铃馨综合培养基：马铃馨200g，麦教50g，葡萄糖20g，M gS化l.Og，蛋白陈5.0g， 琼脂20g，水加至lOOOmL，自然抑。
[0047] PDA培养基:马铃馨200g，葡萄糖20g，琼脂15~20g，自来水lOOOmL，自然抑。
[004引产纤维素酶筛选培养基组成为:簇甲基纤维素钢(CMC-Na)20g，蛋白腺lOg，酵母粉 5g，NaCl 5g，K出P04 1.0g，MgS04.7出0 0.2g，琼脂20g，蒸馈水 1000血，自然pH。
[0049] 产漆酶培养基:PDA-愈创木酪(0.04% )培养基，具体成分包括：马铃馨200g，葡萄 糖20g，琼脂15~20g，愈创木酪0.4g，自来水lOOOmL。
[0050] 产酶发酵培养基组成为：葡萄糖20g，教皮20g，牛肉膏5.0g，K出P〇43.0g，MgS〇4 · 7出01.5g，硫酸铜0.2g，加水至lOOOmL。
[0化1] 一、白黄小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15分离
[0052]从山东省泰安市泰山（海拔800m)采集健康无病症的白花丹参（Sal via miltio;r;rhizaBunge.f.a化aC.Y.WuetH.W.Li)，去腐叶，用清水洗去泥沙及其它杂质， 冲洗干净，置于滤纸上自然风干。将白花丹参的根切成约0.5cm的小段，置于干