三型金属蛋白酶(timp-3)组织抑制剂的变体、组合物和方法
【专利说明】Ξ型金属蛋白酶(TIMP-3)组织抑制剂的变体、组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请主张2013年3月14日提交的美国临时申请号61/782,613;2013年3月15日提 交的美国临时申请号61/798,160; 2013年3月18日提交的美国临时申请号61/802,988和 2014年2月17日提交的美国临时申请号61 /940，673的权益，将所述申请W引用的方式整体 并入本文。
[0003] 对序列表的引用
[0004] 本申请连同序列表一起W电子格式提交。序列表作为2014年3月11日创建的标题 为A-1827W0PCT_^31314的文件提供，其大小是30服B。电子格式的序列表中的信息W引用 的方式整体并入本文。
[000引发明领域
[0006] 本发明一般设及金属蛋白酶抑制剂。具体来讲，本发明设及金属蛋白酶3ΓΤΙΜΡ-3")的组织抑制剂和新颖、有用的变体、突变蛋白及其衍生物。
[0007] 发明背景
[0008] 结缔组织和关节软骨通过胞外基质合成和降解的相对作用维持动态平衡。基质降 解主要是通过金属蛋白酶的酶促作用造成的，包括基质金属蛋白酶(MMP)和具有凝血栓蛋 白基序的去整合素-金属蛋白酶(ADAMTS)。虽然运些酶在许多自然过程(包括发育、形态形 成、骨重塑、创伤愈合和血管生成）中是重要的，但是导致酶水平升高的运些酶的失调被认 为在结缔组织降解性疾病(包括类风湿性关节炎和骨关节炎）中W及在癌症和屯、血管病状 中发挥不利作用。
[0009] 金属蛋白酶的内源性抑制剂包括血浆α2-巨球蛋白和金属蛋白酶的组织抑制剂 (ΤΙΜΡ)，其中有四种已知在人类基因组中编码。ΤΙΜΡ-3抑制所有主要的软骨降解金属蛋白 酶，有多重证明表明它保护软骨。向软骨外植体添加所述蛋白质预防细胞因子诱导的降解， 并且关节内注射减少骨关节炎大鼠内侧半月板损伤模型中的软骨损伤。
[0010] ΜΜΡ的失调还出现充血性屯、力衰竭中并且被认为在众多促炎症反应过程中发挥作 用。然而，作为ΜΜΡ活性的治疗抑制剂开发ΤΙΜΡ-3已经受到重组蛋白质生产W及ΤΙΜΡ-3重组 形式半衰期短的挑战所阻碍。因此，本领域需要显示良好的生产、纯化和药动学/药效学性 质的形式的ΤΙΜΡ-3。
[0011] 附图简述
[001引图1呈现天然的全长人ΤΙΜΡ-3和突变形式的全长人ΤΙΜΡ-3的比对，其中字母?'已 经置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列有下划线；因此其他信号序列可W被置换，如 本文所述。
[0013] 图2呈现天然的全长人ΤΙΜΡ-3,和某些氨基酸置换已经完成的ΤΙΜΡ-3变体的比对。 呈现信号序列并且对于天然的全长ΤΙΜΡ-3序列加 W下划线W保持编号的一致性;其他信号 序列可W因此置换，如本文所述。
[0014] 图3呈现二维多肤图像，其中氨基酸经排列W确定包含ΤΙΜΡ-3的Ν-结构域(残基 23-143)和C-结构域(144-211)的那些残基、W及形成二硫键的半脫氨酸位置。
[001引图4呈现天然的人N末端TIMP3和突变形式的人N末端TIMP3的比对，其中字母?'已 经置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列加 W下划线；因此其他信号序列可W被置换， 如本文所述。设想在成熟形式的Ν末端ΤΙΜΡ-3中的某些置换，并且在本文中表示为其 中V'表示TIMP-3的天然的N末端结构域中的氨基酸，"r表示氨基酸残基数目，且V'表示 已被置换的氨基酸Γ-"表示氨基酸已缺失）。因此，例如，"Κ45Γ指示在氨基酸45处的赖氨 酸化）已被异亮氨酸（I)置换。M67缺失通过M67-表示。用一对甘氨酸置换残基71-77通过 Y70-GG-H78表示。本文中示例的突变形式的人TIMP-3包括W下突变（单独或组合）：R43F、 K45I、K45T、K53T、E54Y、K65T、M67-、K68T、K68I、Y70-GG-H78、H78W。突变的特定组合包括 K45I、K53T、E54Y、K65T、M67-、K68T;K45I、K53T、E54Y、M67-、K68I;K45I、K53T、K65T、M67-、 K68T;K45I、K53T、M67-、K68I;K45I、K53T、M67-、K68I、H78W;K45I、K65T、K68I;K45I、K65T、 M67-、K68T;K45I、K65T、M67-、K68T、H78W;K45I、M67-、K68I、H78W;K45I、M67-、K68T;K45T、 K65T、M67-、K68I;K45T、K65T、M67-、K68T;K53T、E54Y;K53T、H78W;R43F、K45I、K65T、K68I。
[0016] 图5呈现天然的人Ν末端T1MP3和突变形式的人Ν末端TIMP3的比对，其中字母?'已 被置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列加 W下划线；因此其他信号序列可W被置换， 如本文所述。设想在Ν末端ΤΙΜΡ-3的成熟形式中的某些置换，并且在本文中表示为其 中V'表示TIMP-3的天然的N末端结构域中的氨基酸，"r表示氨基酸残基数目，且V'表示 已被置换的氨基酸表示氨基酸已缺失）。因此，例如，"K45E"指示在氨基酸45处的赖氨 酸化)已被谷氨酷胺化)置换。本文中示例的突变形式的人TIMP-3包括W下突变(单独或组 合）：T25G;T25H;T25K;T25P;T25R;T25S;T25W;C26A;S27V;S27A;P28A;P28D;P2^;P28S; S29I;H30A;P31A;Q32A;F35A;C36A;N37A;D39A;V41A;142A;R43A;R43E;R43T;K4祀；V46A; G48A;G48S;K49S;K4犯；L51E;L51T;K53D;E54S;P56N;L60I;V61Q;T63E;T74E;H78D;H78E; Q80E;G116T;C118A;N119D;C143A;和144N-。特定的突变组合包括：S27VS29I;V46AG48S K49E L51E K53D E54S P56N L60I V61Q G116T N119D；C26A C118A；C36A C143A；K45E Κ4犯；Κ4祀 K49S;K4祀 Q80E;K4祀 T63E;K45E T63E H78E;K4祀 T63E H78E Q80E;L51 Τ T74E H78D；R43E T74E H78D Q80E；R43T T74E H78D Q80E；T63E H78D；T63E H78E；T63E H78E Q80E;T63E T74E H78D;T63E T74E H78E;T74E H78D Q80E;T74E H78E Q80E;Y70-GG-7細。
[0017] 图6呈现天然TIMP-2和天然TIMP-3的比对。相应残基中的氨基酸的同一性由序列 下面的星号标明。
【发明内容】
[0018] 在一个实施方案中，本发明提供一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列 方面与SEQ ID N0:2中所示的TIMP-3的成熟区有至少95%同一性的成熟区，具有至少一个 突变，所述突变选自由 W下组成的组:K45E;K45N;K45S; V47T;K49N;K4犯;K49S;K50N; L51T; L51N；V52T；K53T；P56N；F57N；G58T；T63E；T63N；K65T；K65N；M67T；K68S；T74E；K75N；P77T； H78D；H78E；H78N；Q80E；Q80T；K94N；E96T；E96N；V97N；N98T；K99T；D110N；K112T；Q126N； K133S；R138T；R138N；H140T；T158N；K160T；T166N；M168T；G173T；H181N；A183T；R186N； R186Q、R18 犯、K188T;K188Q、K188E、P201N;K203T;1205F、I205Y、A208G、A208V和A208Y。
[0019] 在本发明的另一个实施方案中，提供一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸 序列方面与SEQ ID NO: 2中所示的TIMP-3的成熟区有至少95%同一性的成熟区，具有突变 巧7N和至少一个其他突变，其中所述突变是在TIMP-3的一个或多个K残基处的置换。在本发 明的又一个方面中，所述其他突变向氨基酸序列中引入N-连接的糖基化位点。
[0020] 本发明中还设及一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与SEQ ID N0:2中所示的TIMP-3的成熟区有至少90%同一性的阐述去，其中所述突变蛋白具有至少一 个向氨基酸序列中引入至少一个N-连接的糖基化位点的突变蛋白。在另一个实施方案中， 所述TIMP-3突变蛋白具有两个、Ξ个、四个、五个或六个N-连接的糖基化位点；在又一个实 施方案中，引入的N-连接的糖基化位点的数目是屯个、八个、九个或十个。
[0021] 在本发明的一个实施方案中，所述N-连接的糖基化位点是在选自由W下组成的组 的所述TIMP-3氨基酸序列的区域引入的:包含氨基酸48-54的区域;包含氨基酸93-100的区 域;包含氨基酸121-125的区域;包含氨基酸143-152的区域;氨基酸156-164;包含氨基酸 183-191的区域;及其组合。在另一个实施方案中，所述TIMP-3突变蛋白具有两个、Ξ个、四 个或五个N-连接的糖基化位点；在又一个实施方案中，引入的N-连接的糖基化位点的数目 是六个、屯个、八个、九个或十个。
[0022] 还提供一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与SEQ ID N0:2中所 示的TIMP-3的成熟区有至少95%同一性的成熟区，其中所述突变蛋白具有至少一个选自由 W下组成的组的突变：（a)TIMP-3表面暴露的带正电膜片(patch)中的一个或多个突变，导 致模拟TIMP-2带电表面的TIMP-3带电膜片的特征的改变；（b) -个或多个降低对蛋白水解 裂解敏感度的突变；（C)一个或多个导致TIMP-3突变蛋白与清除受体LRP-1相互作用降低的 突变；（d) -个或多个导致TIMP-3突变蛋白肝素或胞外基质组分的相互作用降低的突变； (e)向天然TIMP-3序列添加一个或多个半脫氨酷残基；（f)改善的药动学和/或药效学性质； 和(g)(a)-(f)中所示的突变的组合。在一个实施方案中，所述突变是在选自由W下组成的 组的TIMP-3氨基酸序列的区域引入的：包含氨基酸48-54的区域;包含氨基酸93-100的区 域;包含氨基酸121-125的区域;包含氨基酸143-152的区域;氨基酸156-164;包含氨基酸 183-191的区域;及其组合。
[0023] 本发明的一个方面是编码根据上述TIMP-3突变蛋白的任一种的TIMP-3突变蛋白 的分离核酸。本发明的其他方面是包括运种分离核酸的表达载体；用所述表达载体转化或 转染的分离宿主细胞;和产生重组TIMP-3突变蛋白的方法，所述方法包括在促进TIMP-3突 变蛋白表达的条件下培养所述转化或转染的宿主细胞W及回收所述TIMP-3突变蛋白。
[0024] 还提供包含本文中描述的TIMP-3突变蛋白的组合物，W及治疗病状的方法，所述 病状中被TIMP-3抑制或可被TIMP-3抑制的基质金属蛋白酶(MMP)和/或其他蛋白酶起成因 或加重作用，所述方法包括对患有运种病状的个体施用足W治疗所述病状的量的运种组合 物。
[0025] 在一个实施方案中，所述病状选自由炎性病状、骨关节炎、屯、肌缺血、再灌注损伤 和发展成充血性屯、力衰竭组成的组。在另一个实施方案中，所述病状选自由哮喘、慢性阻塞 性肺病(C0PD)和特发性肺纤维化(IPF)、炎性肠病(例如，溃瘍性结肠炎、克罗恩氏病和脂泻 病）、银屑病、屯、肌炎(包括病毒屯、肌炎）、动脉粥样硬化相关的炎症、和关节炎病状(包括类 风湿性关节炎和银屑病关节炎)组成的组。
[0026] 在又一个实施方案中，所述病状选自由W下组成的组：营养不良性大瘤型表皮松 解症、骨关节炎、莱特尔氏综合征、假性痛风、类风湿性关节炎(包括青年类风湿性关节炎）、 强直性脊柱炎、硬皮病、牙周病、溃瘍(包括角膜、表皮或胃溃瘍）、手术后创伤愈合、再狭窄、 肺气肿、骨佩吉特氏病、骨质疏松、硬皮病、稱疮中的骨或组织的压迫性萎缩、胆脂瘤、异常 创伤愈合、类风湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎、多关节类风湿性关节炎、全身性发作 类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、肠道致病关节炎、反应性关节炎、莱特尔氏综合征、SEA综 合征(血清阴性、肌腫端病、关节病综合征）、皮肌炎、银屑病关节炎、硬皮病、系统性红斑狼 疮、脉管炎、肌炎、多肌炎、皮肌炎、骨关节炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、动脉炎、风湿 性多肌痛、结节病、硬化症、原发性胆汁硬化症、硬化性胆管炎、干燥综合征、银屑病、斑块状 银屑病、滴状银屑病、反转性银屑病、脈瘤性银屑病、红皮病型银屑病、皮炎、特应性皮炎、动 脉粥样硬化、狼疮、斯蒂尔病、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、炎性肠病、溃瘍性结肠 炎、克罗恩氏病、脂泻病(非热带性口炎性腹泻）、与血清阴性关节病有关的肠病、显微或胶 原结肠炎、嗜酸细胞性胃肠炎、或直肠结肠切除术和回肠肛管吻合术后造成的囊炎、膜腺 炎、膜岛素依赖性糖尿病、乳腺炎、胆囊炎、胆管炎、胆管周炎、多发性硬化(MS)、哮喘（包括 外因性和内因性哮喘W及相关的慢性炎性病状或气道的高反应性）、慢性阻塞性肺病 (COPD，即慢性支气管炎、肺气肿）、急性呼吸道素乱综合征(ARDS)、呼吸窘迫综合征、囊性纤 维化、肺动脉高血压、肺部血管收缩、急性肺损伤、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎、嗜 酸细胞性肺炎、支气管炎、过敏性支气管炎支气管扩张、结核、过敏性肺炎、职业性哮喘、哮 喘样病症、类肉瘤、反应性气道疾病(或功能素乱)综合征、棉尘肺、间质肺病、高嗜酸细胞性 综合征、鼻炎、鼻窦炎和寄生肺病、与病毒诱发的病状有关的气道高反应性(例如，呼吸道合 胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、鼻病毒(RV)和腺病毒）、Guillain-Barre病、格雷夫斯病、 阿狄森氏病、雷诺现象、自身免疫性肝炎、移植物抗宿主病(GVHD )、脑缺血外伤性脑损伤、多 发性硬化、神经病、肌病、脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
[0027] 发明详述
[0028] 本发明提供与TIMP-3多肤、变体、衍生物或突变蛋白有关的组合物、试剂盒和方 法。还提供核酸及其衍生物和片段，包括编码运种TIMP-3多肤、变体、衍生物或突变蛋白的 全部或一部分的核巧酸序列，例如，编码运种TIMP-3多肤、变体、衍生物或突变蛋白的全部 或一部分的核酸;包含运种核酸的质粒和载体，W及包含运种核酸和/或载体和质粒的细胞 或细胞系。提供的方法包括例如，制造、鉴别或分离显示希望的性质的TIMP-3多肤、变体、衍 生物或突变蛋白的方法。
[0029] 在存在的众多病状中，增加哺乳动物中的内源性TIMP-3或升高特定组织中的 TIMP-3的水平是有利的。因此，本文中还提供制造包括TIMP-3多肤、变体、衍生物或突变蛋 白的组合物(诸如药物组合物)的方法，W及对受试者(例如，患有其中基质金属蛋白酶活性 失调导致过度或不当组织重塑的病状的受试者)施用包括TIMP-3多肤、变体、衍生物或突变 蛋白组合物的方法。
[0030] 除非在本文中另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应该具有本领域 技术人员通常所理解的含义。此外，除非另外通过上下文要求，否则单数的术语应该包括复 数并且复数术语应该包括单数。一般来讲，结合本文中描述的细胞和组织培养、分子生物 学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学W及杂交使用的命名法W及其技术是本 领域众所周知并且常用的那些。除非另外指出，否则本发明的方法和技术通常是按照本领 域熟知的传统方法并且如贯穿本说明书引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献所述 进行的。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoiT Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press ,Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和Ausubel等， Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992);W 及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratoiy Press，Cold Spring Ha;rbo;r，N.Y. (1990)，所述参考文献W 引用的方式并入本 文。酶促反应和纯化技术是根据制造商说明书，如本领域中通常所达成或如本文所述来执 行。结合本文中描述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学使用的术语及其实验室 操作和技术是本领域众所周知并且是常用的那些。标准技术可W用于化学合成、化学分析、 药物制剂、配制和输送W及患者治疗。
[0031] 除非另外指出，否则W下术语应被理解为具有W下含义：
[0032] 用于表征分子(其中所述分子是，例如，多肤、多核巧酸或抗体)的术语"分离"表明 所述分子根据其来源或衍生源（1)与伴随其天然状态的天然相关组分无关，（2)基本上没有 来自相同物种的其他分子(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)没有人的干预下不出现在 自然界中。因此，化学合成或在不同于它所天然起源的细胞的细胞系统中合成的分子将是 与其天然相关组分"分离"的。分子还可W使用本领域熟知的纯化技术分离变成基本上没有 天然相关组分。分子纯度或均一性可W通过若干本领域熟知的方法测定。例如，多肤样品的 纯度可W使用聚丙締酷胺凝胶电泳W及使用本领域熟知的技术对凝胶染色使多肤可视化 来测定。为了某些目的，通过使用HPLC或本领域熟知的其他纯化方法可W提供更高的分辨 率。
[0033] 术语"肤"、"多肤"和"蛋白"各自是指包含两个或两个W上彼此通过肤键连接的氨 基酸残基的分子。运些术语涵盖，例如，天然和人造蛋白质、蛋白序列的蛋白质片段和多肤 类似物(如突变蛋白、变体和融合蛋白）W及翻译后或此外共价或非共价修饰的蛋白质。肤、 多肤或蛋白质可W是单体或聚合的。
[0034] 本文使用的术语"多肤片段"是指与相应的全长蛋白质相比具有氨基末端和/或簇 基末端缺失的多肤。片段长度可W是例如，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、 80、90、100、150或200个氨基酸。片段长度还可^是，例如，最多1，000、750、500、250、200、 175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸。片段还可^ 包括(在其一个末端或两个末端的）一个或多个其他氨基酸，例如，来自不同天然存在的蛋 白质的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构)或人造氨基酸序列(例如，人造连接序列或 标签蛋白）。
[003引多肤的"变体"或"突变蛋白"（例如TIMP-3变体或突变蛋白饱含W下氨基酸序列： 其中相对于另一多肤序列，在所述氨基酸序列中插入、缺失和/或置换有一个或多个氨基酸 残基。本发明的变体包括融合蛋白。
[0036]"保守性氨基酸取代"是基本上不改变亲本序列的结构特征的取代(例如，置换氨 基酸不应倾向于打断亲本序列中存在的螺旋，或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构 或是其功能所必需的）。本领域公认的多肤二级和Ξ级结构的实例在Proteins，St;ruc化res and Molecular Principles(Creighton编著，W.Η.Freeman and Company ,New York (1984)) ； Introduction to Protein Structure (C. Branden和J. Tooze编著，Garland Publ ishing，化w 化rk，N. Υ. (1991));和Thormon等，化化re 354:105 (1991)中描述，将其各 自W引用方式并入本文。
[0037] 参考变体或突变蛋白与天然蛋白的相似度的一种方式是参考比较的两种（或更 多）多肤序列或编码核酸序列之间的一致性百分比。两种多核巧酸或两种多肤序列的"一致 性百分比"是通过使用GAP计算机程序（GCG Wisconsin Package的一部分，10.3版 Acceliys，San Diego，CA))用其默认参数比较所述序列确定的。
[0038] 多肤的"衍生物"是已经例如借助于与另一个化学部分(例如，聚乙二醇或白蛋白， 例如，人血清白蛋白）缀合、憐酸化和/或糖基化化学修饰的多肤(例如，TIMP-3多肤、变体或 突变蛋白）。
[0039] 多核巧酸和多肤序列使用标准的一个或Ξ个字母缩写指示的。除非另外指出，否 则每个多肤序列在左边具有氨基末端并且在右边具有簇基末端;每个单链核酸序列和每个 双链核酸序列的上链在左边具有5'末端并且在右边具有3'末端。具体的多肤或多核巧酸序 列还可W通过说明其怎样与引用序列不同来描述。例如，氨基酸的置换在本文中表示为"n# m"，其中V'表示天然的全长多肤中发现的氨基酸，"r表示氨基酸残基数目，V'表示已被 置换的氨基酸。
[0040] 术语"多核巧酸"、"寡核巧酸"和"核酸"自始至终可互换使用并且包括DNA分子(例 如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核巧酸类似物产生的DNA或RNA的类似物 (例如，肤核酸和非天然存在的核巧酸类似物)及其杂化物。核酸分子可W是单链或双链。在 一个实施方案中，本发明的核酸分子包括编码本发明的TIMP-3多肤、片段、变体、衍生物或 突变蛋白的连续开放阅读框。
[0041] 如果两个单链多核巧酸的序列可反平行取向比对使得在不引入缺口 W及在 任何一个序列的5'或3'端没有未配对核巧酸的情况下一个多核巧酸中的每个核巧酸与另 一个多核巧酸中的其互补核巧酸相对，那么两个单链多核巧酸就是彼此的"互补序列"。如 果所述两个多核巧酸可W在适当严格的条件下彼此杂交，那么多核巧酸就与另一个多核巧 酸"互补"。因此，多核巧酸可W与不是其互补序列的另一个多核巧酸互补。
[0042] "载体"是可W用于向细胞中引入与其连接的另一个核酸的核酸。一种类型的载体 是"质粒"，其是指其中可接合其他核酸片段的线性或环状双链DNA。另一种类型的载体是病 毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒），其中可W向所述病毒基因 组中引入其他DNA片段。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制（例如，包含细 菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体） 可在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复 审IJ。"表达载体"是可W引导所选择的多核巧酸的表达的一类载体。
[0043] 如果调控序列影响核巧酸序列的表达(例如，表达的水平、时间或位置），那么核巧 酸序列与调控序列"可操作连接"。"调控序列"是影响其所可操作连接的核酸的表达(例如， 表达的水平、时间或位置）的核酸。调控序列可W，例如，直接对调控的核酸直接发挥其作 用，或通过一种或多种其他分子(例如，结合调控序列和/或核酸的多肤)发挥作用。调控序 列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺巧酸化信号）。调控序列的 其他实例在例如，Goeddel，1990，Gene Expr