一种同时检测aldh2基因*2和adh1b基因*2多态性的引物与方法
【技术领域】
[00011本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种同时检测ALDH2基因*2和ADH1B基 因*2多态性的引物与方法。
【背景技术】
[0002] 乙醇脱氢酶(ADH1B基因编码）和乙醛脱氢酶(ALDH2基因编码）是酒精代谢的关键 酶，其突变可影响酒精代谢进而引起乙醛等有害物质的堆积，影响身体健康。ALDH2基因*2 多态性(NM_000690.3: c. 1510G>A，p.Glu504Lys)可导致乙醛脱氢酶酶活性显著降低，乙醛 代谢至乙酸速度较慢，ADH1B基因*2多态性(NM_000668.5:c. 143A>G，p.His48Arg)可导致 乙醇脱氢酶活性极大增强，乙醇代谢至乙醛的速度较快，促进了体内乙醛的堆积。ALDH2基 因*2和ADH1B基因*2基因多态性均可导致饮酒后体内乙醛堆积，当血液中乙醛达到一定浓 度时，会出现面红、头痛、心动过速、呼吸苦难等不适，表现为对酒精的不耐受性，称为面红 反应。
[0003] 硝酸甘油是心绞痛急性发作时的常规首选药物，但该药的临床疗效常因人而异。 研究显示，中国汉族人群中，硝酸甘油含服无效的比例高达25%以上，而ALDH2基因*2多态性 与部分国人含服硝酸甘油治疗心绞痛无效相关。硝酸甘油主要的药理作用是通过舒张血 管，降低心脏前后负荷，扩张冠状动脉，减少心肌耗氧，从而缓解心绞痛症状，而其舒张血管 作用主要是通过释放N0所介导的。研究发现，乙醛脱氢酶是使硝酸甘油活化并释放N0的关 键酶，硝酸甘油需先在体内经乙醛脱氢酶生物转化，然后才能释放出有药理活性的一氧化 氮(N0)，发挥其抗心绞痛作用。ALDH2基因*2多态性导致乙醛脱氢酶酶活性显著降低，从而 影响了硝酸甘油治疗心绞痛的有效率。
[0004] 检测ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性对硝酸甘油的临床用药及指导人们健康 饮酒具有重要的意义。中国专利申请201510085568.2公开了一种检测ADH1B基因的单一核 苷多型性R49H的基因型和ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型的引物组和定序引 物，但其用于检测ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性准确度不足。现有技术缺少一种检测 特异性和灵敏度高、准确性和精密性好、可实现多个位点同时检测的ALDH2基因*2和ADH1B 基因*2多态性检测引物及其方法。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种同时检测ALDH2基因*2和ADH1B基 因*2多态性的引物与方法，具有不发生交叉反应，检测特异性和灵敏度高，准确性和精密性 好等优点，实现了 ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性的同时检测。本发明同时检测的位点 包括ALDH2基因*2(NM_000690.3 : c . 1510G>A，p .Glu504Lys，rs671)以及ADH1B基因*2(NM_ 000668.5:c.143A>G，p.His48Arg，rsl229984)。
[0006] 本发明提供一种同时检测ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性的引物，包括PCR扩 增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对ALDH2基因*2的上游引物5'-TGGTGGCTACAAGATGTCG-3'（SEQ ID N0.1)和下游引物5'-GCAGGTCCCACACTCACA-3'（SEQ ID N0.2)以及针对ADH1B基因*2的上游引物5'- CAACACTCTCCACGATGC-3'（SEQ ID N0.3)和下 游引物5'_TGAACAGCTTCTCTTTATTCT _3'（SEQ ID N0.4);所述SNaPshot PCR引物包括：针对 ALDH2基因*2的SNaPshotPCR引物5'-ACGGGCTGCAGGCATACACT-3'（SEQIDN0·5)以及针对 ADHlB基因*2的SNaPshotPCR引物5'-TTTTAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTC-3'（SEQIDN0·6)。
[0007] 采用上述技术方案，本发明提供的同时检测ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性的 引物，可以实现ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性的特异性检测，不发生交叉反应，准确性 好。
[0008] 优选地，所述PCR扩增引物中，ALDH2基因*2和ADH1B基因*2的引物浓度比为1:1;所 述SNaPshot PCR引物中，ALDH2基因*2和ADH1B基因*2的引物浓度比为1:1。
[0009] 相应地，本发明还提供一种同时检测ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性的方法， 包括如下步骤： 51、 提取DNA样品； 52、 以步骤S1所述的DNA样本为模板，利用权利要求1或2中所述的PCR扩增引物进行多 重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化，； 53、 以步骤S2所述的纯化后的PCR扩增产物为模板，利用权利要求1或2中所述的 SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化； 54、 采用毛细管电泳技术对步骤S3所述的纯化后的SNaPshot PCR扩增产物进行检测， 并对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[0010 ] 优选地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
[0011] 优选地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:98°C预变性3min，98°C变性 10s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，进行29个循环，最后72°C延伸5min，结束后25°C保温。
[0012] 优选地，所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括:96°C变性10s，55°C退 火5s，60°C延伸30s，进行25个循环，结束后4°C保温。
[0013] 优选地，所述步骤S4中，采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
[0014] 此外，本发明还提供同时检测ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性的引物在制备检 测ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性试剂中的用途。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明提供了一种同时检测ALDH2基因 *2 和ADH1B基因 *2多态性的引物，该引物的特异性好，不会发生交叉反应，准确性好，实现 ALDH2基因 *2和ADH1B基因 *2多态性的同时检测，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一 种同时检测ALDH2基因 *2和ADH1B基因 *2多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增 引物和SNaPshot PCR引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性和精密性好等优点，可以为硝 酸甘油的临床用药与健康饮酒提供指导。
【附图说明】
[0016] 图1本发明提供的ALDH2基因*2和ADH1B基因*2引物的部分扩增片段。
[00Π ]图2本发明提供的ALDH2基因*2和ADH1B基因*2引物扩增产物的部分测序图。
[0018] 图3样品的ALDH2基因*2和ADH1B基因*2多态性检测结果图。
【具体实施方式】
[0019] 以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
[0020] 实施例一引物 发明人针对ALDH2基因*2和ADH1B基因*2的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引 物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好、不会发生交叉反应且PCR反应条件非常接近 的引物。本发明提供的引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，PCR扩增引 物和SNaPshot PCR引物是相对应的。如针对ALDH2基因*2，上游引物为5'_ TGGTGGCTACAAGATGTCG-3'（SEQ ID N0.1)，下游引物为5'-GCAGGTCCCACACTCACA-3'（SEQ ID N0·2)，SNaPshotPCR引物为5'-ACGGGCTGCAGGCATACACT-3'（SEQIDN0·5)。本发明提供的 所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
[0021 ]实施例二引物的特异性 将本发明提供的ALDH2基因*2和ADH1B基因*2引物于UCSC中进行Blasting，结果如下： ALDH2 基因 *2 扩增片段位于 chrl2:112241598+112241871，长度为 274bp;ADHlB 基因 *2 扩增 片段位于chr4:100239170+100239459,长度为SgObpjLDffi基因*2和ADH1B基因*2特异引 物的扩增片段及基因组位置如图1所示，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点： ALDH2基因*2及ADH1B基因*2,无其它同源基因。
[0022]使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品DNA进行扩增及Sanger测序，部分测序结 果如图2所示。测序结果显示，各引物扩增片段与ALDH2基因*2及ADH1B基因*2基因参考序列 吻合。ALDH2基因*2基因参考序列号为ALDH2 NC_000012.12，NM_000690.3;ADH1B基因*2基 因参考序列号为ADH1B NC_000004.12，NM_00066