筛选抗hppd抑制剂类除草剂基因的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因 的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 对羟基苯基丙酮酸双氧化酶（4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，ΗΡΡ?)存 在于各种生物体中，它是一种铁-酪氨酸蛋白，在植物体内可将对羟基丙酮酸（4-Hydroxyphenylpyruvate，ΗΡΡ)催化为尿黑酸（2，5-dihydroxyphenylacetate，HGA)，进而转 化为光合作用中电子传递所需要的重要物质质体醌和生育酚，其中质体醌还是影响八氢番 茄红素去饱和酶催化的关键辅助因子。鉴于其上述重要作用和特点，HPH)成为继ALS、ACC以 及Protox之后的又一新的除草剂靶标酶。由于该酶抑制剂用于除草方面时具有广谱、高效、 残留低、环境相容性好、使用安全的特点，引起人们对其抑制剂研究的重视，该抑制剂的发 现对环境的保护有重大作用，这也是未来除草剂生产发展的趋势。
[0003] 抗除草剂农作物的种植，更充分地利用了除草剂的优势。在过去20年里，抗除草剂 作物给农民和环境都带来了巨大利益。目前生产上种植最多的是抗草甘膦玉米和大豆，从 而使草甘膦的施用非常广泛。随着草甘膦的大量使用，抗草甘膦杂草不断出现，从而影响了 抗草甘膦作物的有效性。因此，开发新型抗除草剂作物，如抗HPPD抑制剂类除草剂作物，势 在必行。
[0004] 本领域已有一些对抗除草剂HPPD基因的研究，但筛选抗除草剂HPPD基因仍然困 难。用植物直接筛选虽然其结果可直接应用，但植物的生长繁殖周期长，传代慢，因此筛选 效率非常低，难以用于实践。抗HPPD抑制剂类除草剂HPPD基因的初步筛选往往是在细菌中 进行。但这些筛选都需要先分离微生物菌株或将HPH)基因克隆在细菌中，再进行单个评估。 这种方法工作量大、范围广、没有针对性，难以进行大规模筛选或从稀有样品中进行筛选。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种筛选抗HPro抑制剂类除草剂基因的方法，运用此种方 法筛选抗HPro抑制剂类除草剂基因，不用对分离的个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操 作简便，可在短时间内筛选得到较多的抗HPro抑制剂类除草剂基因，也容易从稀有样品中 筛选得到抗HPro抑制剂类除草剂基因。
[0006] 一种筛选抗HPro抑制剂类除草剂基因的方法，包括如下步骤：
[0007] 1 )、将含有HPro抑制剂类除草剂抗性微生物的多种微生物在含有HPro抑制剂的抗 性筛选培养基中培养，得到抗性菌种，并对其纯化培养获得单克隆；
[0008] 2)、以所述单克隆的基因组为模板扩增该单克隆的HPPD基因的开放阅读框序列， 将扩增产物连入质粒中并于细菌中进行原核表达，得到重组菌株；
[0009] 3)、对重组菌株的HPro抑制剂抗性进行验证，获得抗HPro抑制剂类除草剂基因。 [0010] HPFO即对羟基苯基丙酮酸双氧化酶（4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase) 〇
[0011] 本发明针对现有的抗HPro抑制剂基因筛选方法中存在的不足，提供了一种快速而 有效地高通量筛选抗HPro抑制剂类除草剂基因的方法，运用此种方法筛选抗HPro抑制剂类 除草剂基因，不用对分离的个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操作简便，可在短时间内 筛选得到较多的抗HPro抑制剂类除草剂基因。
[0012] 优选的，如上所述的筛选抗HPro抑制剂类除草剂基因的方法，在步骤1)中，所述培 养的具体过程为：
[0013] 将微生物样本于含有HPPD抑制剂的抗性筛选培养基中培养1~10次，，且培养次数 大于1次时，在每相邻两次培养所用抗性筛选培养基中，后一次培养的HPro抑制剂浓度均不 低于前一次，且后一次培养的菌种来源于前一次培养中存活下来的微生物菌种。
[0014] 用此方法可筛选到针对不同浓度HPro抑制剂敏感的菌种，亦即该体系能够快速筛 选出不同程度的抗HPro抑制剂类除草剂基因。
[0015]进一步优选的，在步骤3)中，抗性验证具体包括：
[0016]以步骤1)中筛选到的抗性菌种的HPPD抑制剂浓度为最高浓度设置HPPD抑制剂浓 度梯度，将步骤3)中所述重组菌株于HPPD抑制剂含量梯度设置的抗性筛选培养基中培养， 以筛选抗HPH)抑制剂类除草剂基因。
[0017]由于理论上重组菌株的HPro抑制剂抗性不会高于抗性菌种的HPro抑制剂抗性，所 以以抗性菌种的HPro抑制剂浓度为最高浓度。例如筛选到的抗性菌种能够耐受的最高HPro 抑制剂为10mM硝磺草酮，则在步骤3)中，抗性筛选培养基的HPro抑制剂浓度梯度可设置为 0. lmM、0.5mM、ImM、2mM、5mM、10mM硝磺草酮。在具体的应用中，步骤3)中用到的抗性筛选培 养基可能与步骤1)中略有不同，如在步骤1)中提供的抗性筛选培养基配方的基础上加上重 组菌株所具有抗性对应的抗生素。
[0018]优选的，如上所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，所述HPPD抑制剂为 硝磺草酮或环磺酮。
[0019] 硝横草酮（Mesotrione)又名甲基横草酮，分子式C14H13NO7S，分子量339 · 32，CAS No: 104206-82-8。它是一类常用的HPH)抑制剂类除草剂的主要成分。
[0020] 环横酮(Tembotrione)，是由拜耳公司报道的三酮类除草剂，分子式C17H16CIF3O6S， 分子量440.82, CAS No :335104-84-2。
[0021 ]进一步优选的，在步骤1)中：
[0022] HPH)抑制剂含量的范围为1~20mM硝磺草酮或0.25~5mM环磺酮，相邻浓度梯度设 置的间距为1.5~5倍。
[0023]相邻浓度梯度设置的间距为1.5~5倍的含义即后一次培养中培养基的HPPD抑制 剂浓度是前一次培养中培养基的HPro抑制剂浓度的1.5~5倍。
[0024] 优选的，如上所述的筛选抗HPro抑制剂类除草剂基因的方法，所述抗性筛选培养 基为含有1~20mM硝磺草酮或0.25~5mM环磺酮的SMNT基本培养基；
[0025] 按体积份数计，所述SMNT基本培养基包括以下组份：
[0026] 5XM9 盐溶液200 份、245 ~255mM的MgS〇4溶液4.8份、97~103111]\1的〇3(：12溶液1份、 0.128%酪氨酸溶液778~784份、水9~11份；
[0027] 所述5XM9盐溶液中包括：Na2HP〇4 · 7H20 60~68g/L、KH2P〇4l4~16g/L、NaCl 2.4 ~2.6g/L、NH4Cl 4.8~5.2g/L;
[0028] 所述5XM9盐溶液、MgS〇4溶液、CaCl2溶液及0.128%酪氨酸溶液所用溶剂均为水。 [0029]若所筛选的微生物具有HPH)抑制剂抗性，则可在所述抗性筛选培养基中利用酪氨 酸，进而合成质体醌和生育酚从而存活下来。
[0030] 优选的，如上所述的筛选抗HPro抑制剂类除草剂基因的方法，在步骤2)中：
[0031] 当所述单克隆种属未知时，则扩增所述单克隆的部分16s rRNA序列，并将扩增产 物测序以确定所述单克隆种属；
[0032]根据得到的种属信息查询所述单克隆的HPPD基因序列并以此为模板设计引物扩 增得到具有HPro抑制剂抗性的HPro基因片段并测序；
[0033]根据测序结果设计引物，将所述具有HPro抑制剂抗性的HPro基因的开放阅读框序 列连入质粒中并于细菌中进行原核表达。
[0034] 16s rRNA普遍存在于所有细菌染色体基因中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程， 其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中其基因序列较为保守，变 异较小，可看作为生物演变的时间钟，其可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保 守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16s rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来 对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。扩增16