植物诱导型启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子生物学领域中的一种植物诱导型启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 土壤盐渍化、干旱等逆境是植物生长、发育的主要环境限制因素。植物无法逃避逆 境，只能应对。因此，植物演化形成一套感知逆境胁迫、传导逆境信号，并在分子、细胞和生 理水平上响应的精细调控机制。许多研究表明，各种逆境胁迫作用于植物细胞，不仅在转录 后水平调控，还在转录水平调控，诱导逆境响应基因的表达以适应环境。
[0003] 植物诱导型启动子可以精细调节植物在受到外界刺激时基因的表达。诱导型启动 子的研究一直是植物转录表达调控的热点问题，特别是诱导型启动子在植物抗逆转基因育 种中作为关键元件备受关注。目前诱导型启动子主要集中在生物和非生物胁迫诱导启动子 方面，包括响应干旱、高盐、高温、冷害、病害和外源ΑΒΑ胁迫的启动子，其中一些启动子已广 泛应用于植物抗逆转基因育种中。例如，拟南芥Rd29启动子已成功应用于抗旱转基因小麦 育种;高盐、干旱和ΑΒΑ诱导启动子0sNCED3、Wsil8已应用于水稻抗逆转基因育种。尽管目前 已克隆出一些逆境诱导型启动子，但还是不能满足不同植物不同转基因育种的要求，仍需 挖掘和研究新的逆境诱导型启动子。特别是从特殊生境植物克隆逆境诱导启动子的研究还 是比较少。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种植物逆境胁迫诱导型启动子。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种DNA分子。
[0006] 上述DNA分子是植物HbHAK2启动子，来源于野大麦（Hordeum brevisubulatum (Trin. )Link)，为如下 1)或2)或3):
[0007] 1)序列表中SEQ ID No.l所示的DNA;
[0008] 2)在高严谨条件下与序列表中SEQ ID No.l所示的核苷酸序列杂交且具有启动子 活性的DNA分子；
[0009] 3)与所述1)或2)的核苷酸序列具有65%以上的同一性，且具有启动子活性的DNA 分子;具体的，所述同一性为90%以上;再具体的为95%以上;再具体的为96%以上;再具体 的为97%以上;再具体的为98%以上;再具体的为99%以上。
[0010]其中，序列表中的SEQ ID No.l所示的核苷酸序列由744个脱氧核糖核苷酸组成。 [0011]上述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(〇. 25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2， 7%SDS)中，65°C预杂交30min;弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2， 7% SDS，同位素标记的核苷酸片段），65°C杂交12h;弃杂交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸 钠缓冲液，PH7.2，5 % SDS)，65°C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液Π (20mmol/L磷酸钠缓冲 液，pH7 · 2，1 % SDS)，65°C洗膜30min。
[0012]本发明的DNA分子（启动子活性片段)还包括与序列表中SEQ ID No.l所示的核苷 酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语"互补的" 系指遵循碱基配对原则产生的之意。
[0013] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的调控片段的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离 得到的调控片段的核苷酸序列65%或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启 动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0014] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的DNA分子的核苷酸序列具有65 %或更高，优选地75 %或更高，更优选地85 %或更高，甚 至更优选地90%或更高，以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉 眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比 (% )表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0015] 为了解决上述问题，本发明还提供了与上述DNA分子有关的生物材料，为下述A1)-A6)中的任意一种：
[0016] A1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；
[0017] A2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体或含有A1)所述表达盒的重组载体；
[0018] A3)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物、含有A1)所述表达盒的重组微生物 或含有A2)所述重组载体的重组微生物；
[0019] A4)含有权利要求1所述DNA分子的重组细胞系、含有A1)所述表达盒的重组细胞系 或含有A2)所述重组载体的重组细胞系；
[0020] A5)含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物组织、含有A1)所述表达盒的转基因 植物组织或含有A2)所述重组载体的转基因植物组织；
[0021] A6)含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物器官、含有A1)所述表达盒的转基因 植物器官或含有A2)所述重组载体的转基因植物器官。
[0022] 上述表达盒可由所述DNA分子、由DNA分子启动转录的目的基因和终止子组成。
[0023] 上述重组载体可为重组克隆载体或重组表达载体。
[0024] 上述重组表达载体可为将上述DNA分子或表达盒构建到现有植物表达载体上得 到。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如PR0KII、 pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或 pCAMBIAl 391 -Xb (CAMBIA公司）等。
[0025] 所述重组载体具体可为pYBA1121-HbHAK2,是将SEQ ID No.l所示的核苷酸序列插 入到中间载体pYBAl 121的多克隆位点间得到的。
[0026] 上述重组细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官不包括繁殖材料。
[0027] 上述重组微生物可为重组菌或重组病毒。
[0028]本发明还提供了上述DNA分子在作为启动子中的应用。
[0029] 上述应用中，所述启动子为诱导型启动子。
[0030] 上述应用中，所述诱导型启动子具体为逆境胁迫诱导型和/或ΑΒΑ诱导型启动子。
[0031] 本发明还提供了上述DNA分子或上述Al)-A3)中任一所述生物材料在植物体内启 动目的基因表达的应用。
[0032] 上述应用中，所述表达为诱导表达。
[0033] 上述应用中，所述诱导表达为逆境胁迫诱导表达和/或ΑΒΑ诱导表达。
[0034]本发明还提供了上述DNA分子或上述Al)-A3)中任一所述生物材料在培育植物品 种中的应用。
[0035] 本发明还提供了了一种培育转基因植物的方法，是将上述DNA分子和目的基因导 入植物中，得到所述目的基因受逆境胁迫诱导和/或ΑΒΑ诱导表达的转基因植物。
[0036] 上述方法可以通过重组载体pYBA1121_HbHAK2导入植物中实现的。
[0037] 本申请中，所述逆境胁迫为盐胁迫和/或干旱胁迫。
[0038] 本申请中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物;所述双子叶植物具体为十字花 科植物;所述十字花科植物具体为拟南芥;所述单子叶植物可为禾本科植物;所述禾本科植 物具体为野大麦。
[0039] 本发明通过实验证明，在NaCl、PEG和ΑΒΑ不同浓度和不同处理时间下，HbHAK2启动 子均可驱动⑶S基因的表达;但在不处理(对照）、低温(4°C)和高温(42°C)胁迫下，HbHAK2启 动子不能驱动GUS基因的表达。表明HbHAK2启动子是一种新型的诱导型启动子，在高盐、干 旱胁迫和ΑΒΑ处理下均具有较强的启动子活性，可诱导目标基因表达以适应环境。该启动子 可应用于抗逆基因工程载体构建、植物抗逆分子机制研究和农作物耐盐、抗旱转基因育种。 为植物的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用 空间和市场前景。
【附图说明】
[0040] 图1为载体ΡΥΒΑ1121的质粒图谱。
[00411图2为转pr0HbHAK2:GUS拟南芥和空载体对照株系的PCR扩增产物电泳图谱。
[0042] Marker为TRANSlKb(购买自天根生化科技(北京)有限公司）；质粒为PCR扩增阳性 对照；1-11为转pr〇HbHAK2: GUS株系;Col为野生型拟南芥;Empty为转空载体对照株系。 [0043] 图3为转proHbHAK2: GUS拟南芥株系经不同处理后的⑶S染色结果。
[0044] 图4为经不同处理的转proHbHAK2: GUS拟南芥中GUS基因的相对表达量。
【具体实施方式】
[0045]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 野大麦（Hordeum brevisubulatum(Trin. )Link)公众可从北京市农林科学院获 得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0047] 载体pYBA1121为BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心(http : // www·biovector .net/product/163197 .html，400-800-2947)产品。
[0048] Hoagland 营养液配方（1L) :0.51g/L KN03、0.82g/L Ca(N03)2、0.49g/L MgS〇4.7H20、0.136g/L KH2P〇4、lmL Fe EDTA溶液和lmL A-Z溶液。其中，Fe EDTA溶液配制方 法为：分别溶解7.45g Na2EDTA、5.57g FeS〇4.7H20于200mL蒸馏水中，加热、不断搅拌使 Na2EDTA溶液与FeS〇4溶液混合，然后定容至1L;A-Z溶液的配方为：2·80mg/L H3B〇3、0·08mg/ L CuS〇4 · 5H20、0.22mg/L ZnS〇4 · 7H20、81mg/L MgCh · 6H2O和0.09mg/L HM〇0 · 4H20。
[0049] MS培养基配方:4.3g/L MS粉末、20g/L蔗糖、6g/L植物凝胶，pH5.8。
[0050] GUS染液配方：10mmol/L EDTA-Na2、0.5mmol/L K3Fe(CN)6、0.5mmol/L K4Fe(CN)6 · 3H20、lmg/mL X-gluc、0·1 %TritonX-100，pH7·0〇
[00511实施例l、HbHAK2启动子的获得 [0052] -、野大麦的培养
[0053] 盐生牧草-野大麦(Hordeum brevisubulatum(Trin. )Link)，采自内蒙古盐渍化草 原。在室温条件下，野大麦种子用去离子水浸泡12h后，放入到4°C冰箱中过夜。用灭菌的去 离子水冲洗3遍，放于湿润纱布的培养皿中，25°C萌芽。经过4-5天待其大部分发芽之后，转 到灭菌的盛有l/2Hoagland培养液的玻璃瓶中（用不透光的纸包住），在温度22-23°C，光照 强度1000-3000ymol nrS'光照12h/天、黑暗12h/天的条件下生长，待长到两叶一心时取 材备用。
[0054] 二、HbHAK2启动子的克隆
[0055]采用CTAB法提取野大麦的基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增引物 如下：
[0056] proHbHAK2-F:5 '-TGAGCTCAAACTCATTCGACATCATGTCG