用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针、其制备方法、应用及测试方法
【专利说明】用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针、其制备方法、应 用及测试方法
[0001] -、技术领域 本发明涉及一种比率型pH荧光探针、其制备方法、应用及测试方法，尤其是一种用于水 溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针、其制备方法、应用及测试方法。
[0002] 二、【背景技术】 细胞内pH值在许多细胞行为中发挥重要作用，如细胞生长，细胞凋亡，信号转导和细胞 增殖等。作为细胞健康的一个重要指标，细胞内pH的微小变化可以导致细胞异常，甚至会引 起细胞功能障碍和严重的疾病，如癌症和阿尔茨海默氏病。细胞内的pH值不是相同的，细胞 质是弱碱性的。而溶酶体内部pH值约为4.0-6.0，呈弱酸性。溶酶体内的弱酸性环境可以活 化内部水解酶的功能，在细胞代谢中分解蛋白质。因此，用于水溶性定位溶酶体的比率型pH 荧光探针、其制备方法、应用及测试方法是对溶酶体的pH值定量检测对细胞分析或诊断的 方法，在现有的比率型pH荧光探针和其制备方法及应用中，检测细胞内pH值的方法主要有 核磁共振、吸收光谱和荧光光谱等，荧光检测技术由于灵敏度高，操作方便，可以实时监测 等优点而得到了广泛应用，但是大部分荧光探针都是检测单个波长荧光强度的变化，该类 探针输出信号会受到温度、溶剂极性、探针浓度的影响，会影响检测结果的准确性。
[0003] 三、
【发明内容】
本发明的客体其一是一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针， 本发明的客体其二是一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针的其制备方法， 本发明的客体其三是一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针的应用， 本发明的客体其四是一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针的测试方法。
[0004] 为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种用于水溶性定位溶酶体的比率 型pH荧光探针、其制备方法、应用及测试方法，因此同时检测两个发射波长的荧光强度变 化，通过自校准消除外界影响，提高检测准确性。
[0005] 为达到上述目的，本发明采取的技术方案是： 一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针，其化学结构式如下式所示：
[0006] 由于设计了比率型pH荧光探针，通过用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针 的荧光共振能量转移FRET机制表明，因此同时检测两个发射波长的荧光强度变化，通过自 校准消除外界影响，提高检测准确性。
[0007] 本发明设计了，一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针，具有： 核磁共振氢谱测定结果 JHNMR (DMS0-d6,300 ΜΗζ)，δ (ppm) = 8.71-8.75 (m，1H)， 8.67 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.80 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 7.51 (t, J =4.5 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 1.5 Hz, J = 7.5 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.30-6.43 (m, 6H), 4.03 (s, 3H), 3.39-3.48 (m, 4H), 3.18-3.32 (m, 10H), 1.56-1.64 (m, 2H), 1.39 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 0.97-1.09 (m, 12H), 0.91 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 磁共振碳谱测定结果：13C NMR (DMS〇-d6, 75 MHz), δ (ppm) = 12.31 (4C), 13.48 (2C), 21.66 (2C), 25.12, 28.57, 29.96, 43.51 (3C), 64.31, 64.31, 97.27 (2C), 104.74 (2C), 108.07 (2C), 110.93 (2C), 116.01, 119.24, 121.51, 122.22, 123.60, 124.20, 128.25, 128.60, 130.65 (2C), 131.45, 132.68, 138.47 (2C), 152.51 (2C), 153.87, 163.76, 167.69, 高分辨质谱测定结果：Calcd. [M_I]-: 733.3633; found value - : 733.3623, 的化合物。
[0008] 本发明设计了，一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针的其制备方法， 其步骤： 中间化合物m、H0BT (1-羟基苯并三唑）、EDC[ 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐]、三乙胺溶解于DMF中得到中间溶液中，将中间化合物V加入到中间溶液中，反应得 到最终化合物RMPM， 其中：中间化合物m化学结构式如下式所示：
中间化合物V化学结构式如下式所示：
[0009] 本发明设计了，一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针的其制备方法， 其步骤:其步骤： 中间化合物mi.0-1.4 mmol、HOBT 1.0-1.4 mmol、EDC 1.0-1.4 mmol、三乙胺 1.8-2.2 mmol溶解于DMF18-22mL中，在氮气保护下室温搅拌0.8-1.2h，得到中间溶液，然后将中间化 合物V0.8-1.2 mmol加入到中间溶液中，在氮气保护下，室温搅拌18-22h，硅胶板跟踪确定 反应终点，将反应液减压蒸发浓缩得粗终端化合物，将粗终端化合物用二氯甲烷和水中萃 取，收集有机相，干燥，浓缩，然后通过柱色谱纯化，得到的淡黄色固体即终端化合物RMPM， 收率 45.2%，熔点：197-201°(3。
[0010] 本发明设计了，一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针的其制备方法， 其步骤:其步骤： 3-丁基-1-氯咪唑并〔1，5-α〕吡啶-7-羧酸乙酯即中间化合物I8-12mmol和Na0H18-22mmol溶解在乙醇18-22ml和水13-17ml的混合溶液中，回流反应1.8-2.2 h后，将所得溶液 倒入180-220 ml水中，用稀盐酸1.8-2.2M中和至中性，有黄色固体析出过滤，用水洗涤2 X 5mL，在烘箱中50°C干燥后，得到黄色固体即中间化合物Π ，收率为90.8%， 将中间化合物n8-12mmol和CH3I 48-52mmol溶解在四氢呋喃28-32ml溶液中，在氮气 保护下加热回流反应7.8-8.2h，冷却到室温，析出黄色固体，通过真空抽滤，滤饼用乙酸乙 酯8-12ml洗涤3次，得到黄色的固体即中间化合物ΙΠ ，收率为73.0%， 中间化合物V可以通过由在文献中的方法制的中间化合物IV和乙二胺反应合成， 其中：中间化合物IV化学结构式如下式所示：
[0011] 本发明设计了，一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针的其制备方法的 合成路线如下：
本发明设计了，一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针作为比率型pH荧光探 针的应用。
[0012] 本发明设计了，一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针作为测定pH为 5.8到6.8的比率型pH荧光探针的应用。
[0013] 本发明设计了，一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针作为在Hela细胞 的比率型pH荧光探针的应用。
[0014] 本发明设计了，一种用于水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针的测试方法，其 步骤：配制上述水溶性定位溶酶体的比率型pH荧光探针，在不同pH值下的溶液（乙醇/ Britton-Robinson缓冲溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:4，体积比），通过焚光分光光度法测 试其对不同pH值的响应能力； 在酸性条件下向上述含pH荧光探针的溶液中分别定量加入AgN03, Al(N03)3，Ba(N03) 2， Cd(N03)2，Co(N03)2, Cu(N03)2，Fe(N03)3，HgC12，Ni (N03)2, Pb(N03)2，Zn(N03)2的 水溶液，测试其抗干扰能力； 使用不同浓度的上述pH荧光探针培养Hela细胞，分别进行荧光成像，观察细胞内荧光 强度变化， 使用上述pH焚光探针与商品化的溶酶体探针Lysosensor? Green DND-189对活Hela 细胞共染色，通过荧光成像进行染色定位， 使用一定浓度不同pH值的上述pH荧光探针培养Hela细胞，观察荧光强度和红色荧光/ 蓝色荧光比率的变化， 使用一定浓度的上述pH荧光探针培养Hela细胞，在激光的连续激发下，观察蓝色荧光/ 红色荧光的比率的变化，测试该探针在Hela细胞中的光稳定性， 使用一定浓度的上述pH荧光探针培养Hela细胞6 h后，检测探针对Hela细胞存活率的 影响。
[0015] 本发明的技术效果在于:所述活细胞优选Hela细胞。定位溶酶体的pH荧光探针响 应迅速，具有优良的水溶性，对多种金属离子具有良好抗干扰能力。在pH从5.8到6.8范围内 变化显著，适应弱酸性条件下pH检测。该探针可以选择将Hela细胞中的溶酶体染色，可用于 在活细胞中pH的检测。上述探针具有罗丹明-咪唑并[1，5_α]吡啶结构，当pH值从5.50增加 到7.00，咪唑并[1，5-α]吡啶基团的蓝色荧光几乎是不变的。同时，罗丹明基团