基于AllGlo探针的rs2844682检测分型试剂盒及其分型方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及单核巧酸多态性(SNP)，尤其是设及一种基于AllGlo探针的rs2844682 检测分型试剂盒及其分型方法。
【背景技术】
[0002] 单核巧酸多态性（single nucleotide polymor曲ism,SNP),主要是指在基因组水 平上由单个核巧酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一 种。SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达 300万个甚至更多。作为第Ξ代遗传标志，SNP与人体许多表型差异、药物易感性与疾病易感 性密切相关。SNP在基因组中的大量存在，使其成为一个强有力的工具，在疾病定位与克隆、 药物的设计和测试W及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。
[0003] 个体化诊断治疗是未来医学发展的大方向。将个体化的祀点定位于某个基因，甚 至是单个核巧酸，发现疾病的遗传标志物，将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展 疾病预防、诊断和治疗。基因的SNP是形成个体间差异的重要遗传学基础，通过SNP与疾病和 药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可W通过所检测出的SNP预测、确定与疾病有关的基 因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据运一特点选择治疗 效果最好，不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。
[0004] SNP在疾病的预防、诊断、治疗及个体化医学发展中扮演着重要的角色，因此准确 快速的进行SNP检测分型具有重大的意义。
[0005] 目前，SNP分型的方法主要有直接测序技术法、限制性片段长度多态性技术 (RFLP)、化gman巧光探针法、扩增阻滞突变系统(ARMS)、高分辨烙解曲线分析法化RM)等。其 中，直接测序法是目前最直观，准确性相对而言最高的SNP分型方法，但其步骤多而分散，成 本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测;限制性片段长度多态性技 术(RFLP)作为一种最早的DNA标记技术，对仪器要求低，只需要一台PCR仪W及电泳仪器即 可进行实验，但其实验操作繁琐，检测周期长，不适合大样本检测;Tagman巧光探针法准确 度较好，但其设计合成程序复杂，并且不适合多位点少量样本的分型，尤其是频率偏低的位 点；扩增阻滞突变系统(ARMS法)快速、简便，但是不能闭管操作，对基因多态性分析难W实 现高通量、自动化;高分辨烙解曲线分析法化IM)具有简单、快速等优点，但该方法特异性不 足，仪器选择少。
[0006] AllGlo探针作为新一代的巧光探针，在具备化qMan-MGB探针优点的基础上，大大 提高信噪比，减少背景巧光信号。目前，AllGlo探针已经成功应用于检测瘤疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突变巧611邑，2.1.￥11,乂.￥.1^11,2.]\1.66]1邑，0.￥.211日]1邑，1^.化6]1,5.]\1?日口1(1 detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo?probes[J].Clin Chim Acta,2011,412( 11-12) :1018-1021 )、侵袭性曲霉菌病(Wu，D.S. aienJ.Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0007] 药物方面的研究发现，人类白细胞抗原HLA-B*15:02会显著地增加卡马西平药物 不良反应发生的风险，导致严重的皮肤反应，例如史蒂文斯一约翰逊综合征(SJS)和中毒性 表皮坏死松解症（TEN) (Grover S,Kukreti R(2014)HLA alleles and hypersensitivity to carbamazepine: an updated systematic review with meta-analysis.Pharmacogenet Genomics 24:94-112.doi:10.1097/FPC.0000000000000021)〇
[0008] 有报道表明HLA-B*15:02所导致的药物不良反应不仅局限于卡马西平，在一些与 卡马西平结构类似的药物中也会出现SJS/TEN，例如苯妥英钢、拉莫Ξ嗦等（Bloch KM， Sills GJ,Pirmohamed M,Alfirevic A(2014)Pharmacogenetics of antiepileptic drug-induced hypersensitivity .Pharmacogenomics 15:857-868.do1:10.2217/ pgs.l4.65)。化pMap显示，在中国汉族人群中单核巧酸多态性位点rs2844682可W作为HLA-B*15:02的一个标签SNP，利用rs2844682的检测分型能有效鉴别HLA-B*15:02,用药前检测 患者HLA-B*15:02,鉴别出药物不良反应个体，避免严重药物毒副反应，为临床治疗用药提 供重要的参考依据。在个体化诊断与治疗快速发展的背景下，rs2844682作为HLA-B*15:02 的标签SNP，与多种临床药物不良反应的密切联系使其成为了一个极具医学潜力的SNP位 点，因此急需一种更快速高效的SNP分型方法来满足精准医学的发展。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的之一在于针对现有检测SNP方法中使用的试剂盒和检测方法存在的 上述缺陷，提供基于AllGlo探针的rs2844682检测分型试剂盒。
[0010] 本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针的rs2844682检测分型方法。
[0011] 所述基于AllGlo探针rs2844682检测分型试剂盒，包括实时巧光定量PCR试剂、阳 性对照及阴性对照；
[0012] 所述rs2844682为美国国家生物技术信息中屯、(NCBI)所提供的SNP位点编号。
[001引所述实时巧光定量PCR试剂包括W下组份：10 X Taq缓冲液、10m mol的MgCl2、加 /μ L的Taq Hotstad DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLOW ROXaOOmL无核酶水、10μ mol/L rs2844682的特异正向引物、10ymol/L rs2844682的特异反向引物和AllGlo探针；所 述lOXTaq缓冲液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[0014] 所述rs2844682的特异正向引物的核巧酸序列为：
[0015] 沈Q ID NO.1:5 >-ATAAAATGGGTCAGGATGGGC-3 >;
[0016] 所述rsl799945的特异反向引物的核巧酸序列为：
[0017] SEQ ID N0.2:5'-TTCTGACTGTCCCGTTGGC-3'。
[001引所述A1 IGlo探针为rs2844682的特异探针，其核巧酸序列为：
[0019] SEQ ID N0.3：rs2844682-G:MAR-CTCCAAGGGATTG-MAR；
[0020] SEQ ID N0.4：rs2844682-A:JUP-CTCCAAGGAATTG-JUP〇
[0021 ] 所述阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品；所述 阳性纯合对照品1为rs2844682分型为GG的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为rs2844682分 型为AA的DNA样品，所述阳性杂合对照品为rs2844682分型为GA的DNA样品。
[0022]所述阴性对照为ImL的无核酶水。
[0023] 所述基于AllGlo探针的rs2844682检测分型方法，包括W下步骤：
[0024] 1)采用常规方法提取邸TA抗凝全血样本中的DNA;
[0025] 2)采用所述基于AllGlo探针的rs2844682检测分型试剂盒提供的实时巧光定量 PCR试剂将DNA进行实时巧光定量PCR扩增；
[00%] 3)根据检测到的巧光信号对rs2844682SNP位点进行分型。
[0027] 所述AllGlo探针可采用美国AlleLogic Biosciences Co巧oration公司的巧光定 量探针，它拥有普通化qman，化qman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，克 服了目前运几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman-端报告基团一端泽灭基团的限 审ij，利用了美国AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制巧 光染料，标记在寡核巧酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可W提高Tm 值(退火溫度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标 记的染料又全部变为报告基团，提高巧光增量。
[00%]所述AllGlo探针具有W下优势：①提高Tm值(可达10°CW上），探针更短可W达到 15~16个碱基，可W适用A，T含量比较高的序列设计探针;②加大了多重巧光定量的选择， 因为每种染料即是报告基团又是泽灭基团，打破传统化qman探针因波长原因标记选择困 难，不受泽灭基团波长限制；③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的泽灭效 果;④成本较低，价格仅相当于化qman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。
[0029] 本发明采用了 AllGlo探针技术，设计了特异性引物和相应的AllGlo探针，探针分 别标记巧巾特殊巧光基团(MAR、