一种人体肠道十大优势菌定量检测试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物生态学领域，具体是一种人体肠道十大优势菌定量检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 构成人体肠道微生态系统的微生物细胞数达1〇14个，相当于人自身细胞数量的10 倍，它们所携带的基因总数是人体所携带的基因总数的100倍，其最为显著的特征是其结构 在一定的时期内的稳定性，并影响着人体消化道的结构和功能，参与营养物质的吸收和代 谢等，在维持肠道正常生理功能、调节机体免疫、抵御外来致病菌的侵入等方面发挥重要的 作用。已公认肠道生态微的结构和功能的改变与宿主的肥胖，糖尿病、肠易激综合征（IBS)、 炎性肠病（I抓）、肠癌等疾病相关。因此，肠道微生态平衡与否，是衡量人体肠道健康与否的 标志。肠杆菌化nterobacter)，该菌科为人体肠道内正常菌群，参与人体的代谢及免疫，但 该菌属，尤其是大肠杆菌，很大一部分菌为致病菌或条件致病菌，当人体免疫力低下或细菌 侵入肠道W外部位时，也可引起疾病多脂饮食，会造成该菌科条件致病菌菌群增加。肠球菌 化nterococcus)，是人及动物肠道中正常菌群的一部分，它不像乳酸菌一样被认为是安全 可靠的，当抗生素大量使用或宿主免疫力低下时，宿主与肠球菌之间的共生状态失衡，肠球 菌离开正常寄居部位进入其他组织器官，分泌细胞溶解素、明胶酶等毒力因子侵袭破坏宿 主组织细胞，引起宿主的非特异性免疫应答。拟杆菌(Bacterooides)，参与人体多种代谢过 程，部分菌株被报道具有条件致病性，易引起机体的机会性感染。该菌可调节营养吸收，粘 膜免疫，外源物质代谢，及肠粘膜血管的形成及发育等。双歧杆菌(Bifidobacteria)、乳酸 菌化actic Acid Bacteria,LAB)，参与机体多种代谢过程，并产乳酸，为双歧杆菌是有益菌 的代表，促进肠道蠕动，改善便秘，减少吗I噪，亚硝酸胺等致癌物质产生，促进矿物质及维生 素 D的吸收和利用等，及增强机体免疫功能。同时可将人体无法吸收的胆固醇转变成粪酱 醇，从粪便中排出，具有降血脂的功能等等，为人体健康的晴雨表。奇异菌属 (Atopobiumcluster)从葡萄糖主要的发酵产物是乳酸，其他尚有乙酸和甲酸。产下酸菌 (Butyric Acid Bacteria,BAB),代表菌：酪酸梭菌（Clostridial clustersI.，CGl)，柔嫩梭 菌(C. leptum)，直肠真杆菌巧ubacterium rectale)，普拉氏梭杆菌化.prausnitzii)。下酸 在肠道健康方面起着十分重要的作用，一方面，为肠粘膜细胞的主要能量来源，一方面抑制 肠道中的致病菌，保持肠道菌群平衡，从而预防和治疗肠道疾病方面起至决定性作用。如普 拉梭菌，为肠道一种抗炎的细菌，有报道称其可W抵消克罗恩病(Crohn's Disease)患者体 内的异常免疫反应对消化道的损伤。同时，它与8种人体的代谢物质有统计相关性，参与宿 主多种代谢过程。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种人体肠道十大优势菌定量检测试剂盒，W解决上述背 景技术中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 一种人体肠道十大优势菌定量检测试剂盒，包括标本采集管、厚壁管、Buffer A、10% SDS、2*SybGreen PCR预混液、标准品、阴性质控品和阳性质控品，所述标本采集管有50支， 规格为500 ± 50mg，内含2ml粪便DAN稳定剂;所述厚壁管有50支，规格为2ml;所述Buf f er A 有1瓶，规格为500ml，其主要成分为氯化钢和Tris-Hcl;所述10% SDS有一支，规格为10ml， 其主要成分为10%十二烷基硫酸钢;所述2*SybGreen PCR预混液有10份，规格为1200ul/管， 其主要成分为反应缓冲液、SybGreen巧光染料、DNTPs、引物;所述标准品有10支，规格为1〇11 拷贝数/每支，标准品内含人工构建的质粒;所述阴性质控品有2份，规格为500ul/管，其主 要成分为生理盐水;所述阳性质控品有10分，规格为500ul/管，其主要成分为已知拷贝数的 灭活的克隆菌培养液;所述试剂盒在使用时需准备无水乙醇、酪、酪-氯仿-异戊醇、氯仿-异 戊醇W及样本均质器和离屯、机。
[000引作为本发明进一步的方案： 其使用步骤方法为： (1) 样本采集： 使用样品采集托盘留取好粪便;旋下样本采集管管帽，取出与管帽相连接的定量采集 器;将采集器下端垂直于样品采集托盘中的粪便按压几次，确认粪便充满整个采集器;将采 集器放回样品采集管，旋紧管帽；按压管帽上部突出装置，使粪便掉入管体下部DNA保存液 中，然后剧烈晃动几次，确保混匀;贴上相应信息标签，完成采样； (2) 样本处理与DNA提取： 称量0.3g硅胶珠(直径0.1mm)加入厚壁管中；将粪便标本从采集管中转移到厚壁管中 (体积大概为1.2ml)，加入Buff er A 400ul，同时加入酪150ul;样品均质器击打两次;放入-80°C冰箱中lOmin，随后60°C溫浴2min，混匀；冻融后冰上放置Imin;加入llOul 10%SDS冰 上放置lOmin;混合液加入150ul氯仿-异戊醇(v/v，24:1)，15g，离屯、5min取上清;上清分别 用等体积的酪、酪-氯仿-异戊醇(v/v，25:24:l)、氯仿-异戊醇(v/v，24:l)各抽提2次、2次、1 次，每次均15g离屯、5min取上清;氯仿-异戊醇抽提之后，上清加入1/10体积的醋酸钢(3M， P册.2);用2倍体积的无水乙醇沉淀过夜;沉淀过夜之后，15g离屯、lOmin后，真空干燥或者于 烘箱干燥lOmin，溶于300ul无菌水中； PCR扩增： 取N个(N=阴性质控品+待测样本+阳性质控品）PCR反应管，每管分别加入2 X SybGreen PCR预混液反应液lOul、引物1.2ul (上、下游引物分别为0.6ul)、ROX 0.5ul、去离子水 7.3u 1、模板1U1 (也可按照每人份的用量，计算2 X SybGreen PCR预混液、引物、R0X、去离子 水各自所需总量，Ξ者混匀后分装19ul于单个PCR反应管中）;于上述PCR反应管中分别加入 处理后的阴性质控品、待测样本混浊液（请吸打混匀后吸取）、阳性质控品及标准品lul 3000rpm离屯、30秒，放入PCR扩增仪;设置循环条件为，94°C3分钟，1个循环;93°C15秒一 60°C 45秒，40个循环(每个循环结束后读取反应管的巧光值）；设置完成后，保存文件，运行程序； 结果换算： 报告所定义的值=定量检测结果/该样本DNA浓度，即为每ng粪便微生物总DNA中所含 待测菌的DNA拷由贝数。
[0006]与现有技术相比，本发明能够定量检测人粪便中的十大优势菌核酸，包括肠杆菌 (Enterobacter)、肠球菌（Enterococcus)、拟杆菌（Bacterooides)、双歧杆菌 (Bifidobacteria)、乳酸菌(Xactic Acid Bacteria,LAB)、奇异菌属（Atopobiumcluster)、 柔嫩梭菌（C. leptum)、直肠真杆菌（Eubacterium rectale)、普拉氏梭杆菌 (F.prausnitzii)和酪酸梭菌（Clostridial clusters I，CGI)，为临床肠道微生态素乱患 者提供肠道优势菌菌群水平失调的监测及微生态制剂重建肠道微生态疗效评价的重要参 考依据，能够使我们对患者肠道微生态的结构有更直接地了解，通过微生态调节剂前后对 比菌群的数量水平真实地反映患者肠道微生态重建的情况，从而且对微生态调节剂药物的 选择、有效治疗、精确预后及新药研制等各方面具有重大意义。
【具体实施方式】
[0007] 下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0008] -种人体肠道十大优势菌定量检测试剂盒，包括标本采集管、厚壁管、Buffer A、 10% SDS、2巧ybGreen PCR预混液、标准品、阴性质控品和阳性质控品，所述标本采集管有50 支，规格为500 ± 50mg，内含2ml粪便DAN稳定剂;所述厚壁管有50支，规格为2ml;所述Buf f er A有1瓶，规格为500ml，其主要成分为氯化钢和化is-Hcl;所述10% SDS有一支，规格为10ml， 其主要成分为10%十二烷基硫酸钢;所述2*SybGreen PCR预混液有10份，规格为1200ul/管， 其主要成分为反应缓冲液、SybGreen巧光染料、DNTPs、引物;所述标准品有10支，规格为1〇11 拷贝数/每支，标准品内含人工构建的质粒;所述阴性质控品有2份，规格为500ul/管，其主 要成分为生理盐水;所述阳性质控品有10分，规格为500ul/管，其主要成分为已知拷贝数的 灭活的克隆菌培养液;所述试剂盒在使用时需准备无水乙醇、酪、酪-氯仿-异戊醇、氯仿-异 戊醇W及样本均质器和离屯、机。
[0009] 其使用步骤方法为： (1)样本采集： 使用样品采集托盘留取好粪便;旋下样本采集管管帽，取出与管帽相连接的定量采集 器;将采集器下端垂直于样品采集托盘中的粪便按压几次，确认粪便充满整个采集器;将采 集器放回样品采集管，旋紧管帽；按压管帽上部突出装置，使粪便掉入管体下部DNA保存液 中，然后剧烈晃动几次，确保混匀；贴上相应信息标签，完成采样;样品专用采集管中含有 DNA稳定剂，采集好的标本可W在常溫下稳定放置，但是为了结果的可靠性，不要在高溫环 境(〉26°C)下长时间放置，尽早送至实验室，如放置时间过久，需重新留取样本。
[0010] (3)样本处理与DNA提取： 称量0.3g硅胶珠(直径0.1mm)加入厚壁管中；将粪便标本从采集管中转移到厚壁管中 (体积大概为1.2ml)，加入Buf f er A 400ul，同时加入酪150u 1;样品均质器击打两次;放入-80°C冰箱中lOmin，随后60°C溫浴2min，混匀；冻融后冰上放置Imin;加入llOul 10%SDS冰 上放置lOmin;混合液加入150ul氯仿-异戊醇(v/v, 24:1)，15g，离屯、5min取上清;上清分别 用等体积的酪、酪-氯仿-异戊醇(v/v，25:24:l)、氯仿-异戊醇(v/v，24:l)各抽提2次、2次、1 次，每次均15g离屯、5min取上清;氯仿-异戊醇抽提之后，上清加入1/10体积的醋酸钢(3M， P册.2);用2倍体积的无水乙醇沉淀过夜;沉淀过夜之后，15g离屯、lOmin后，真空干燥或者于 烘箱干燥lOmin，溶于300ul无菌水中； PCR扩增： 取N个(N=阴性质控品+待测样本+阳性质控品）PCR反应管，每管分别加入2 X SybGreen PCR预混液反应液lOul、引物1.2ul (上、下游引物分别为Ο . 6ul)、ROX Ο . 5ul、去离子水 7.3u 1、模板1U1 (也可按照每人份的用量，计算2 X S