一种检测hUCMSCs增殖能力及其临床应用价值的试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学生物检测领域，具体是一种适用于检测hUCMSCs增殖能力，并W此 判定hUCMSCs是否具有临床应用价值的试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源于发育早期的中胚层和外胚 层，是干细胞家族的重要成员。其中人厮带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUCMSCs)是存在于厮带中的一种MSCs,引其具有取材方便，易于 采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，避免了伦理争议，细胞数量多 等优点。在干细胞治疗领域的应用中备受关注。研究人员发现，hUCMSCs可诱导为多种功能 性组织细胞，可用于治疗脑擁、脊髓损伤、老年痴呆、多发性硬化等神经系统疾病、I型糖尿 病等疾病的治疗。目前，hUCMSCs在临床疾病治疗中的应用价值已被广泛认可，且已通过PAD 认证。研究发现，早期hUCMSCs细胞生物学活性良好，临床应用价值高，晚期细胞增殖活性显 著降低，临床应用价值明显降低。参阅文献发现，目前尚没有通过特定指标衡量hUCMSCs的 可用性。
[0003] 小核仁RNA(small nucleolus RNAs，snoRNAs)是一类发现较早且位于核仁内的小 非编码RNA。snoRNAs对rRNA的化学修饰作用是其进本功能。另外，有研究表明snoRNAs与一 些遗传疾病W及肿瘤性疾病的发生发展存在密切关联。
[0004] 研究发现，部分snoRNA对细胞的增殖具有调控作用，运里，本发明人在前期工作发 现随hUCMSCs代数增加、细胞增殖减慢，活性降低，snoRA7A的表达量呈下降趋势，且在 hUCMSCs培养值第7代后，snoRNA呈显著下降趋势。而此后hUCMSCs生物学活性差，临床应用 价值低，不被选择应用于临床治疗。（参见文献（l)Pacilli，A.，Ceccarelli，C.，Trere，D.，& Montanaro,L..SnoRNA USOlevels are regulated by cell proliferation and rRNA transcription.Int J Mol Sci,2013,14(7)：14923-14935.)〇
[0005] 目前尚无文献报道有关snoRA7A用于衡量hUCMSCs增殖能力W及评估hUCMSCs是否 具有临床应用价值的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的首要目的是解决上述技术问题和指标问题，提出一种检测hUCMSCs增殖 能力，判定其临床应用价值的小分子RNA(snoRNA)标志物。
[0007] 为解决上述技术及指标问题，本发明对多批次培养的不同代数hUCMSCs增殖能力 进行了详细研究，发现在所有培养批次的hUCMSCs细胞中，随hUCMSCs代数增加，snoRA7A表 达量呈下降趋势，且第6代到第7代表达量下降明显。
[000引本发明的第一方面，提供了一种检测hUCMSCs增殖能力，判定其临床应用价值的小 分子 RNA(snoRNA)标志物：snoRA7A。
[0009]所述的snoRA7A，GenBa址 accession numbe;r:AJ609430,具体序列如下：
[0010] GACCTCCTGGGATCGCATCTGGAGAGTGCCTAGTATTCTGCCAGCTTCGGAAAGGGAGGGAAAGCAAGCCTGGCAGA GGCACCCATTCCATTCCCAGCTTGCTCCGTAGCTGGCGATTGGAAGACACTCTGCGACAGTG(SEQ ID NO:1)〇 [00川本发明的第二方面，提供了上述标志物snoRNA在制备hUCMSCs增殖能力检测试剂 或试剂盒中的应用。
[0012] 所述的检测试剂或试剂盒检测hUCMSCs内snoRA7A的表达水平。
[0013] 所述的检测试剂或试剂盒包括:对snoRA7A具有检测特异性的探针、基因忍片，或 PCR引物。
[0014] 优选的，所述的检测试剂或试剂盒为采用Real-time RT-PCR(qPCR)方法检测 snoRA7A表达量的试剂或试剂盒。
[0015] 优选的，所述的对snoRA7A具有检测特异性的PCR引物的核巧酸序列分别如SEQ ID ^:2、569 10^:3所示。
[0016] 本发明的第Ξ方面，提供一种检测hUCMSCs增殖能力及其临床应用价值的试剂盒， 所述的试剂盒中包括用于检测snoRA7A表达量的试剂。
[0017] 优选的，所述的试剂为采用Real-time RT-PCR(qPCR)方法检测snoRA7A表达量的 试剂。
[0018] 优选的，所述的试剂盒中含有两组引物，分别为：
[0019] snoRA7A的引物：
[0020] P1:CATTCCCAGCTTGCTCCGTA(SEQ ID N0:2)
[0021] P2:ACTGTCGCAGAGTGTCTTCC(SEQ ID N0:3)〇
[0022] GAPDH引物：
[0023] P1：CTTGGGCTACACTGAGGACC(SEQ ID NO:4)
[0024] P2:CATACCAGGAAATGAGCTTGAC(沈Q ID N0:5)
[0025] 本发明的第四方面，提供一种检测hUCMSCs增殖能力及其临床应用价值的方法，通 过检测hUCMSCs内snoRA7A的表达水平鉴定hUCMSCs增殖能力，判定hUCMSCs临床应用价值。
[0026] 本发明还提供了用于衡量hUCMSCs增殖能力及临床可用性的snoRA7A表达量的参 考值 ACT-snoRA7A:
[0027] Δ Ct-snoRA7A = Ct-snoRA7A-Ct-GAP畑
[0028] 本发明通过检测Δ Ct-snoRA7A的水平，用W鉴定hUCMSCs增殖能力，判定hUCMSCs 实际应用价值:若Δ Ct-snoRA7A为8 W下则表示细胞活性高，临床可用价值高。
[0029] 本发明的第五方面，提供检测snoRA7A表达水平的试剂在制备hUCMSCs增殖能力检 测试剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明的第六方面，提供序列SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、N0.4、N0.5所示引物的 用途，用于制备hUCMSCs增殖能力检测试剂或试剂盒。
[0031] 本发明的有益效果在于：
[0032] 1、首次发现了对增殖能力具有较高鉴定价值的生物标志物snoRA7A，通过细胞增 殖能力检测试剂盒的研制和应用，可W更便捷、更准确评价hUCMSCs增殖能力及临床可用 性；
[0033] 2、本发明将人厮带间充质干细中snoRA7A的表达量进行了量化，通过多次检测证 实了该检测指标可用于检测细胞增殖能力从而判定其临床应用价值。该发现为huMSC体外 培养传代过程中细胞增殖能力的检测及其细胞临床可用性评定提供了方便快捷的检测方 法。
【附图说明】
[0034] 图1为不同代数hUCMSCs倍增时间。
[0035] 图2为不同代数hUCMSCs中snoRA7 A表达量变化。
[0036] 图3为不同代数hUCMSCs中snoRA7A的具体Δ CT值。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0038] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南KNew ￥〇'4:〔〇1(1591'；[]1旨化1'13〇1'1^日13〇^1:〇巧？'633，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0039] 实施例1
[0040] -、研究方法
[0041] 1.细胞倍增时间试验
[0042] ① T25培养瓶常规培养细胞至细胞密度达80% ,0.25%膜酶消化为单胞，用含血清 培养基3ml中和膜酶作用，制成单细胞悬液。
[0043] ②取1 Ou 1放入细胞计数仪中进行细胞计数。
[0044] ③取5 X 103个细胞于10cm2培养皿中，常规培养至细胞密度达80 %后依照上述方法 消化为单细胞并进行计数(细胞数为N)，同时记录细胞培养总时间(T)。
[0045] ④化= N/(5X 103)计算得η(细胞增殖倍数）
[0046] ⑤倍增时间（t) = Τ/η
[0047] 2.使用miRcute miRNA Isolation KitmiRcute miRNA提取分离试剂盒提取富集 细胞内20~200nt RNA。
[004引具体操作过程如下：
[0049] ①直接在培养板中加入裂解液MZ裂解细胞，每10cm2面积加1ml MZ。用取样器抽打 几次。
[0050] (注意:裂解液MZ的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不 足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。另注：也可制备细胞悬液：离屯、2，100rpm( 400 X g) 5min取细胞，弃上清。加入1ml裂解液MZ，振荡器振荡或移液器吸打数次混匀。加裂解液MZ前 不要洗涂细胞，免降解m