肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法
【专利说明】
[0001 ]本申请是分案申请，其原申请的国际申请号是PCT/肝2012/079182，国际申请日是 2012年11月9日，中国国家申请号为201280050798.X，进入中国的日期为2014年4月16日，发 明名称为"肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法"。
技术领域
[0002] 本发明设及基因重组技术在肌肉肌醇的制造中的应用。特别是设及利用原核微生 物的转化体的肌肉肌醇的工业制造方法。本发明进一步设及新颖的肌肉肌醇衍生物及其制 造方法。
【背景技术】
[0003] 肌肉肌醇对于多数高等动物来说为必不可缺的物质，因而其作为营养食品、饲料、 药品等成分广泛使用。例如，已知肌肉肌醇在脂肪和胆固醇类的代谢中发挥出重要的作用， 在高胆固醇血症等的预防或治疗中是特别有效的。因而，对于W工业规模制造肌肉肌醇的 制造工艺提出了多种改良方案。
[0004] W往，肌肉肌醇是从米慷、玉米浆等直接提取的，但该提取方法中，肌肉肌醇的收 率低，并且大量生成杂质，因而肌肉肌醇的精制困难，生产效率极低。因此，还有人提出了对 具有肌肉肌醇生产能力的面包酵母进行培养，由该培养物中生成肌肉肌醇的方法，但该方 法的生产率仍然较低，在经济上不成立，因而未进行工业实施。
[000引因而，对更加有效地生产肌醇的微生物进行了检索。专利文献1公开了可向菌体外 分泌肌醇的假丝酵母属酵母的表达及其利用。专利文献2和3分别公开了在上述假丝酵母属 酵母中导入可赋予针对葡萄糖代谢抵抗物质和抗生素的耐性的突变的内容。另外，在专利 文献4、5和6中还分别公开了通过在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针 对叔胺、六氯环己烧和十六烷基Ξ甲基锭盐的耐性的突变来提高肌醇的收率的内容。专利 文献7中同样公开了在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对6-面代-6-脱氧葡萄糖的耐性的突变的内容。在专利文献8中还公开了在具有肌醇生产能力的假丝酵 母属酵母中导入可赋予针对面化乙酷甲酸的耐性的突变的内容。
[0006] 进一步地，现有技术还记载了利用基因重组进行的酵母的转化。在专利文献9中公 开了下述内容:在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中，肌醇-1-憐酸合成酶承担控速反应， 在运一恰当推论下，通过单独利用编码上述肌醇-1-憐酸合成酶的DNA对不具有肌醇分泌能 力的假丝酵母属酵母进行转化而对该酵母赋予肌醇生产能力。在专利文献10中公开了通过 将置于甘油-3-憐酸脱氨酶基因启动子的调节下的编码肌醇-1-憐酸合成酶的DNA单独导入 酵母，来提高该酵母的肌醇生产率的内容。
[0007] 进一步地，专利文献11中还设及甲醇利用性酵母毕赤酵母进行肌醇生产的内容， 其中公开了在该酵母中导入肌肉肌醇-1-憐酸合成酶基因并同时导入肌醇憐酸憐酸醋酶基 因的内容，但未明确该追加的肌醇憐酸憐酸醋酶基因导入的意义和效果。
[0008] 因而，关于上述酵母的任一文献均是W在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中肌 醇-1-憐酸合成酶承担控速反应为前提的，并未暗示存在于肌肉肌醇生物合成通路中的除 此W外的酶的重要性。
[0009] 另一方面，对于W大肠杆菌为代表的原核微生物，由于其旺盛的增殖能力及发酵 管理中的各种优越性，与酵母相比，其为极富魅力的工业生产用生物。但是，具有内源性肌 肉肌醇生物合成通路的原核微生物尚不为人所知。
[0010] 因而，为了利用原核微生物进行肌肉肌醇的工业生产，在原核微生物宿主内构建 外来性的肌肉肌醇生物合成通路为不可缺的。
[0011] 具体地说，为了在原核微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路，下述催 化剂活性为必要的：
[0012] 活性1:由适当的碳源生成葡萄糖-6-憐酸的活性；
[0013] 活性2:将葡萄糖-6-憐酸转换为肌肉肌醇-1-憐酸的活性、即肌醇-1-憐酸合成酶 活性;和
[0014] 活性3: W肌肉肌醇-1-憐酸为底物的憐酸醋酶活性。
[0015] 但是，由于作为活性1的生成物的葡萄糖-6-憐酸为原核微生物普遍产生的代谢中 间体，因而对原核微生物赋予该活性并非为必须的。此外，对于活性3来说，就本发明人所 知，大多数适于通过现有的基因重组方法进行工业生产的原核微生物宿主细胞表达内源性 肌醇单憐酸酶、或者具有能够W肌肉肌醇-1-憐酸为底物的通用单憐酸酶活性。此外，若对 活性2进行观察，则多为原核微生物不具有肌醇-1-憐酸合成酶基因的示例。并且，如上所 述，在肌肉肌醇生物合成反应中，认为肌醇-1-憐酸合成酶承担控速反应。因而，为了在原核 微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路，认为在该细胞中导入肌醇-1-憐酸合成 酶基因是充分必要的。
[0016] 实际上，非专利文献1公开了肌肉肌醇在大肠杆菌转化体内的生产，但仅在该转化 体中导入了肌醇-1-憐酸合成酶基因。
[0017] 专利文献12中还公开了在大肠杆菌宿主细胞中仅导入肌醇-1-憐酸合成酶基因来 制作转化体、由此在该转化体内构建外来性肌肉肌醇生物合成通路的内容。但是，该文献的 最终目的生成物为D-葡糖二酸，肌肉肌醇是作为中间体生产的。特别要指出的是，该文献中 还记载了下述内容："还应该注意到，本发明中的suhB基因或相同的憐酸醋酶并未过剩表 达。但是，在培养产物中未检测出肌肉肌醇-1-憐酸，另一方面却蓄积了肌肉肌醇。因而发明 人得出结论，憐酸醋酶活性并未限制通过通路的代谢流(flux)。"（第33页、第2~5行）。
[0018] 因而，现有技术并未公开或暗示肌醇单憐酸酶在通过重组微生物进行肌肉肌醇生 产中的决定性作用。
[0019] 现有技术文献
[0020] 专利文献
[0021 ] 专利文献1:日本特开平8-00258号公报
[0022] 专利文献2:日本特开平8-38188号公报
[0023] 专利文献3:日本特开平8-89262号公报
[0024] 专利文献4:日本特开平9-117295号公报 [00巧]专利文献5:日本特开平10-42860号公报
[0026] 专利文献6:日本特开平10-42882号公报
[0027] 专利文献7:日本特开平10-42883号公报 [002引专利文献8:日本特开2000-41689公报
[0029] 专利文献9:日本特开平9-220093号公报
[0030] 专利文献10:日本特开平10-271995号公报 [0031 ] 专利文献11:日本特开2011-55722号公报
[0032] 专利文献12:W02009/145838号小册子
[0033] 非专利文献
[0034] 非专利文献 1:J. Am. Chem.Soc. 1999, Vol. 121,3799-3800
【发明内容】
[0035] 发明所要解决的课题
[0036] 对于不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的微生物，通过使用与基因重组技术联 合的合成生物学方法，其具有容易调节肌肉肌醇生产率的优点。特别是大肠杆菌等原核微 生物宿主除了不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路W外，还不具有多数酵母所具有的肌醇 同化能力（分解能力），因而更容易应用合成生物学的方法。此外，对于大肠杆菌来说，由于 其迅速的生长能力及发酵管理的容易性，从工业发酵生产的方面考虑其是极富魅力的，同 时从应用基因重组技术时的实际成绩、确定的安全性的方面出发也具有优点。
[0037] 因而，本发明所要解决的课题在于对不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主 微生物赋予显著得到改善的肌肉肌醇和相关衍生物的生产能力。
[0038] 解决课题的手段
[0039] 如上所述，在迄今为止的任一研究中，均暗示了肌醇-1-憐酸合成酶在肌肉肌醇生 物合成反应中承担控速反应的内容。并且，在任一研究中均未对肌醇单憐酸酶活性予W特 別关注。
[0040] 但是，本发明人令人吃惊地发现，在不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主 微生物内导入肌肉肌醇生物合成通路而得到的转化体中，肌醇单憐酸酶活性具有重大的作 用。出人预料地，通过增强肌醇单憐酸酶活性，运样的转化体的肌肉肌醇生产能力大幅提 高。本发明人进一步发现，在运样的转化体的培养物中表达出了新型的肌肉肌醇衍生物。
[0041] 因而，本发明的第1方面在于：
[0042] (1) -种肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序：
[0043] 1)准备转化体的工序，该转化体为不表达内源性肌醇-1-憐酸合成酶的微生物的 转化体，其至少含有W能够在该转化体内表达的方式导入的编码肌醇-1-憐酸合成酶的外 来基因，并且具有对该转化体内的功能性肌醇单憐酸酶的过剩生产或肌醇单憐酸酶的活化 进行诱导的基因重组或变异；W及
[0044] 2)在适于上述转化体的生长和/或维持的条件下，使该转化体与能够由该转化体 转换为肌肉肌醇的碳源进行接触的工序。
[0045] 更特定地说，上述制造方法为使用下述转化体的肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制 造方法，该转化体为具有W能够表达的方式导入到不表达内源性肌醇-1-憐酸合成酶的微 生物内的编码肌醇-1-憐酸合成酶的外来基因的转化体，其特征在于，上述转化体具有对功 能性肌醇单憐酸酶的过剩生产或肌醇单憐酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。
[0046] 上述(1)的培养物中生产的肌肉肌醇衍生物为新颖的化合物，在该衍生物中，葡萄 糖与肌肉肌醇呈化^4键合。因而，本发明的一个方式为：
[0047] (2)如上述（1)所述的制造方法，其中，上述肌肉肌醇衍生物为下述结构式所表示 的化合物：
[004引[化1]
[0049] 〇
[0050] 前面已经对合成生物学方法的应用和发酵生产中的原核微生物、特别是大肠杆菌 的优点进行了叙述。因而，本发明的适宜方式包括：
[0051] (3)如上述（1)或（2)所述的制造方法，其中，上述不表达内源性肌醇-1-憐酸合成 酶的微生物为原核生物；
[0052] (4)如上述（1)或（3)的任一项所述的制造方法，其中，上述不表达内源性肌醇-1-憐酸合成酶的微生物为具有内源性肌醇单憐酸酶基因的微生物；
[0053] (5)如上述（1)或（4)的任一项所述的制造方法，其中，上述不表达内源性肌醇-1-憐酸合成酶的微生物为选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属 细菌组成的组中的细菌；W及
[0054] (6)如上述(5)所述的制造方法，其中，上述细菌为大肠杆菌。
[0055] 无论宿主微生物是否具有内源性肌醇单憐酸酶活性，通过在该细胞内过剩生产肌 醇单憐酸酶，可增强该细胞的肌醇单憐酸酶活性。可应用各种公知的技术进行肌醇单憐酸 酶的过剩生产。因而，本发明包括W下的方式：
[0056] (7)如上述（1)或(6)的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单憐酸酶的过剩生 产是通过对上述微生物进行下述操作而诱导的：
[0057] a)导入外来肌醇单憐酸酶基因；
[0058] b)增加内源性肌醇单憐酸酶基因的拷贝数；
[0059] C)在内源性肌醇单憐酸酶基因的调节区域导入变异；
[0060] d)利用高表达诱导性外来调节区域来置换内源性肌醇单憐酸酶基因的调节区域； 或者
[0061] e)使内源性肌醇单憐酸酶基因的调节区域缺失；W及
[0062] (8)如上述(7)所述的制造方法，其中，上述肌醇单憐酸酶的过剩生产是通过对上 述微生物导入外来肌醇单憐酸酶基因而诱导的。
[0063] 此外，在宿主细胞具有内源性肌醇单憐酸