芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒、方法和试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及遗传工程领域，具体设及芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒、方法和试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 芽胞杆菌(Bacillus)是细菌的一科，指能形成芽胞（内生胞子）的杆菌或球菌，包 括芽胞杆菌属、芽胞乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽胞八叠球菌属等，它们对外界有 害因子抵抗力强，分布广。芽胞杆菌种属中有许多被美国FDA认定为GRAS (Generally Recognized as Safe)菌株，在工业、农业、食品及医疗等领域都有着重要的应用价值。芽胞 杆菌各属拥有各自生物学特性，通过分子遗传育种，可W选育出特定功能强势的菌种，应用 于工农业生产各个方面。芽胞杆菌基因敲除技术是研究基因功能的重要手段，利用该技术 进行分子生物学研究有利于加深对芽胞杆菌代谢调控机制的认识。近年来随着大量芽胞杆 菌的基因组数据的公布，采用基因工程学育种的方法改造菌种成为当下遗传育种研究的热 点，芽胞杆菌遗传学研究和代谢工程研究迫切需要一种快速，无痕和高效的基因敲除和敲 入的载体工具。
[0003] 传统基因敲除质粒载体构建方法是将待敲除基因上下游DNA片段和抗性基因片段 分别通过酶切连接或无缝克隆的方法整合到基因敲除骨架载体上，其最大的弊端是最终的 敲除菌株的基因组中会留下抗性基因和其它载体片段，对该菌株进一步的基因敲除和筛选 不利，限定了敲除菌株的应用范围，如带有外源抗性基因和载体片段的敲除菌株不适合于 食品类产品的生产。
[0004] 为了实现基因的无痕敲除，更好地筛选发生同源重组的阳性转化子，早期的研究 者开发了一系列基于正负筛选系统的基因无痕敲除方法。运类方法一般分为两步，第一步 采用正筛选标记验证敲除载体与基因组发生了单交换或双交换，第二步，迫使基因组发生 第二次同源重组，通过负筛选标记筛选阳性克隆子。常用的正筛选标记有：抗生素抗性基 因，黄嚷岭/鸟嚷岭转移酶基因，次黄嚷岭转移酶基因，胸腺喀晚转移酶基因，嚷岭霉素乙酷 转移酶等。常用的负筛选标记有mazF、upp、blaI、ysbC、hwel、SacB等，其中在芽胞杆菌基因 无痕敲除中应用较多的是mazF (大肠毒性蛋白基因）和UPP (尿喀晚憐酸核糖基转移酶基 因）。来自于大肠杆菌的毒性蛋白基因 mazF用时间长了之后会累计产生抗mazF敏感性菌株， 且敲除构建载体过程比较复杂，mazF的泄漏表达会使大肠杆菌致死，使得敲除载体易于发 生基因突变或缺失。而UPP的应用需要首先敲除宿主的内源基因，通用性较差，且喀晚类似 物5-氣尿喀晚(5FU)的纯度和稳定性对阳性克隆子的筛选非常大，筛选工作量较大。此外， 运类敲除质粒一般不能在芽胞杆菌中自主复制，与基因组发生同源重组多数情况下是利用 同源双交换的原理，而且芽胞杆菌的转化效率普遍较低，发生单交换的效率都比较低，发生 双交换的概率更低，鉴定和验证的工作量大，实际操作过程比较费时费力。
[0005] 此外，利用来源于金黄色酿脈葡萄球菌的质粒PE194中的溫敏型复制子构建的敲 除质粒实现芽胞杆菌中基因的无痕敲除也有成功的例子(Qi G，Kang Y，Li L，Xiao A， Zhang S, Wen Z, Xu D, Chen S, Deletion of meso-2,3-butanediol Dehydrogenase Gene budC for Enhanced D~2, 3- butanedio1 Production in Bacillus 1;[油6]11;1!'〇1'11113,6;[016油]1〇1.6;[(^6111,2014,7:16).运类敲除质粒能够在芽胞杆菌中 复制，而且能通过升高溫度胁迫敲除质粒与基因组发生同源单交换，增加了与基因组发生 同源重组的概率。但发生同源单交换的菌株在筛选同源双交换时只能依靠重复序列的自发 重复剪接，效率比较低，筛选工作量大，周期长。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中基因敲除或敲入概率低、筛选鉴定和验证工作量大、成功率 低、周期长等问题，本发明提供了一种芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒。本发明还提供了一 种用于增强敲除或敲入效率的辅助质粒。本发明还提供了一种基因敲除或敲入方法。本发 明还提供了一种基因敲除或敲入试剂盒。
[0007] 本发明提供的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒，该质粒的基因组中含有： 仅一种正筛选标记的抗性基因，该抗性基因的启动子为双功能启动子； 能在大肠杆菌中复制的复制子； 能在芽胞杆菌中复制的溫敏型复制子； 至少一个I-Scel酶切位点； 仅一种显色蛋白基因，该显色蛋白基因的启动子为组成型启动子； 所述双功能启动子是指既能在大肠杆菌中启动基因表达，也能在芽胞杆菌中启动基因 表达的启动子。
[0008] 所述的组成型启动子，是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一 定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。
[0009] 优选地，上述芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒中，所述组成型启动子的核巧酸序列 如SEQ ID NO.2~13中的任意一条所示。运些启动子均选自芽胞杆菌：如P43 (SEQ ID NO. 2)，Pamy (沈Q ID NO. 3)，PliaG (沈Q ID NO. 4)，PyxiE (沈Q ID NO. 5)，Pcwp (沈Q ID N0.6)，P2(WQIDN0.7)，P5(WQIDN0.8)，PleipA(WQIDN0.9)，PyrkA(WQID NO. 10)，Pveg (沈Q ID NO. ll)，PgsiB (沈Q ID NO. 12)或化巧3Aa (沈Q ID NO. 13)。
[0010] 优选地，上述芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒中，所述抗性基因为卡那霉素基因 Kan、氯霉素基因 Cm、四环素基因 Tet、红霉素基因 Erm或博来霉素基因化ble。
[0011] 优选地，上述芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒中，所述显色蛋白基因为绿色巧光蛋 白基因或红色巧光蛋白基因，所述红色巧光蛋白基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 优选地，上述芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒中，所述溫敏型复制子的核巧酸序列 如沈Q ID NO. 14~16中的任意一条所示。
[0013] 其中SEQ ID NO.14的序列来自祀194质粒（源自金黄色酿脈葡萄球菌)的复制子； SEQ ID NO. 15的序列来自pWVOl质粒（源自乳酸乳球菌）的复制子;SEQ ID NO. 16的序列来 自W上两种质粒复制子的突变形式。
[0014] 本发明提供的一种辅助质粒，用于辅助提高W上任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲 除/入质粒的基因敲除或敲入效率，该质粒的基因组中含有： 仅一种正筛选标记的抗性基因，且该抗性基因 W上任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲 除/入质粒基因组中的正筛选标记的抗性基因不同，该抗性基因的启动子为双功能启动子； 能在芽胞杆菌中复制的溫敏型复制子； 能在大肠杆菌中复制的复制子； 内切酶I-Scel基因； 仅一种显色蛋白基因，且与芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组中的显色蛋白基因 不同，该显色蛋白基因的启动子为组成型启动子； 所述双功能启动子是指既能在大肠杆菌中启动基因表达，也能在芽抱杆菌中启动基因 表达的启动子； 其中，启动内切酶I-Scel基因表达的启动子是芽胞杆菌中的诱导型启动子。
[0015] 所述诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动 子可W大幅度地提高基因的转录水平，即其启动基因转录的功能需要经过条件诱导。
[0016] 内切酶I-Scel是一种由内含子编码的归位内切酶，该内含子存在于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的线粒体中。
[0017] 优选地，上述辅助质粒中，所述内切酶I-Scel基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 17 所示;辅助质粒(溫敏型）中的显色蛋白基因为绿色巧光蛋白基因、红色巧光蛋白基因、bgaB 基因（显蓝色）、邻苯二酪2,3-双加氧酶显色标志基因 xy化（显黄色）或酪氨酸酶-黑色素报 告基因 melM(显黑色）。
[0018] 辅助质粒中的两种复制子与芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组中的两种复制 子相同。其中溫敏型复制子核巧酸序列如SEQ ID NO. 14~16任意一条所示。
[0019]优选地，上述辅助质粒中，所述诱导型启动子的核巧酸序列如SEQ ID NO. 18~25中 任意一条所示。
[0020] 本发明提供的一种芽胞杆菌基因无痕敲除/入方法，当需要敲除目的基因时，包括 W下步骤： (1) 分别扩增待敲除基因的上、下游同源臂，通过重叠 PCR方法连接在一起，克隆至W上 任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组，测序验证正确的质粒转化芽胞杆菌，在 含有质粒中抗性基因对应的抗生素培养基上42~44°C条件下培养，并设置用于检测质粒中 显色基因表达情况的显色条件，筛选出发生同源单交换的菌株； (2) 将W上任一所述的辅助质粒转化到发生同源单交换的菌株中，在含有辅助质粒中 抗性基因