Gi型诺如病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种含有诺如病毒GI型基因的病毒样颗粒的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]诺如病毒，又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses，NV)是人类杯状病毒科(HumanCalici virus，HuCV)中诺如病毒(Norovirus，NV)属的原型代表株。它是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻患者粪便中分离的病原。2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒，它与在日本发现的札幌样病毒，合称为人类杯状病毒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15%左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。
[0003]目前，食品中NV-GI检测的常用方法有RT-PCR技术和荧光定量RT-PCR技术，为了保证检测的准确性，实验中必须设立阳性对照或质控品。通常使用病毒培养物或是由RNA逆转录得到的cDNA做标准品，但是前者存在生物安全的隐患且易被核糖核酸酶降解，后者不能体现核酸提取过程和反转录对试验的影响。本发明采用Armored RNA技术，构建包裹甲肝病毒基因的假病毒标准样品，此假病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控品可以对从核酸提取至RT-PCR检测的全过程进行有效的监控。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是:构建包裹NV-GI基因的假病毒标准样品，此假病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控品可以对从核酸提取至RT-PCR检测的全过程进行有效的监控。
[0005]本发明为解决上述技术问题，将编码组氨酸标签序列插入MS2噬菌体编码外壳蛋白的β发夹环结构序列中，构建含有重组组氨酸标签的MS2噬菌体外壳蛋白和表达成熟酶蛋白基因的pNH-MS2his重组质粒。并通过RT-RCR技术扩增NV-GI基因，将其克隆于pNH-MS2his中，构建原核重组表达质粒pNH-MS2his-NV-GI。并将其转化于表达大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达。结果表明，表达的重组蛋白能够自主装配形成VLPs，而且其中含有NV-GI的基因RNA序列，并且该RNA序列具有良好的稳定性，可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品用于临床及样品检测。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
本发明设计了一组扩增NV-GI基因引物，序列如下:
NV-GIfl: ATACCCACTCCATGGTGAGAAATTT；
NV-GIrl: AAGAGAGGGTCAGAAGCATTAACC；
5‘端分别加上Hind III和Not I酶切位点。
[0007]本发明提供一种pNH_MS2his重组质粒，pNH_MS2his重组质粒中插入的NV-GI基因片段序列如下:
CACTCCATGGTGAGAAATTTTACAGAAAGATTTCCAGCAAGGTCATACATGAAATCAAGACTGGTGGATTGGA
AATGTATGTCCCAGGATGGCAGGCCATGTTCCGCTGGATGCGCTTCCATGACCTCGGATTGTGGACAGGAGATCGCG
ATCTTCTGCCCGAATTCGTAAATGATGATGGCGTCTAAGGACGCTACATCAAGCGTGGATGGCGCTAGTGGCGCTGG
TCAGTTGGTACCGGAGGTTAATGCTTCTGACCCTC。
[0008]本发明还提供一种制备含有NV-GI基因的病毒样颗粒标准物质的方法，包括以下步骤:
(I)含有组氨酸标签的重组质粒pET-NH-MS2his的构建
将pET32a质粒使用Xba I和Nco I消化，去除其中的Xba I和Nco I两个酶切位点间的序列，将人工合成的5 ’ -P04-CTAGATTACAAGGC-3 ’ 和5 ’ -P04-CATGGCCTTGTAAT-3 ’ 两条互补的寡核苷酸复性后插入其中，构建重组质粒pET-NH，测序鉴定。
[0009]采用一步法扩增试剂盒以MS2Pfl和MS2Prl为引物，以MS2 RNA为模板扩增MS2目的片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒(TaKaRa)回收目的片段，用50yL ddH20洗脱，标记为MS2 DNA。
[0010]采用OneStep RT-PCR，以得到的MS2 DNA为模板，分别用引物MS2Pfl和ms2hispr和ms2hispf和MS2Prl扩增MS2上和MS2下2个DNA片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后，存于4°C备用。再以2个片段的混合物为模板，以MS2Pfl和MS2Prl为引物做PCR，得到引入了编码组氨酸标签序列的MS2 DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后的PCR产物命名为MS2his。
[0011]分别将制备的pET-NH载体和回收的MS2his片段用限制性内切酶BamHI和Hind ΙΠ进行酶切消化。将双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后与PET-NH载体用Solut1nI连接酶进行连接。连接产物转化DH5a感受态细胞，挑取单菌落作进行酶切鉴定。从平板培养基上挑选单菌落接种至5 ml的含有Amp抗生素的液体培养基中，37°C振荡培养12-16小时，参照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。以提取的质粒为模板，以MS2Pf和MS2Pr为引物进行PCR扩增。将PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。若可见载体与
I700 bp左右的MS2目的片段即为阳性。
[0012](2)构建重组质粒 pNH-MS2his-NV_GI
按RNA提取试剂盒说明书的方法提取NV总RNA作为模版，以NV-GIfl\ NV-GIrl为引物扩增NV-GI蛋白基因，RT-PCR体系为:5XRT-PCR buffer 5yL，dNTP mix IyL,Enzyme Mix IyL，引物NF和NR各IyL，RNA模板5yL，ddH20补足25 yL，反应条件为，50°C反转录30min，95°C灭火变性lOmin，然后95°C lmin，55°C lmin，72°C I min，40个循环，最后72°C延伸 10 min。扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见263bp左右的条带图1，宝生物凝胶回收试剂盒回收NV-GI蛋白片段。
[0013]Hindm和NotI双酶切pNH_MS2his和NV-GI蛋白片段，胶回收试剂盒回收酶切的pNH-MS2his和NV-GI蛋白片段，回收产物16°C连接过夜。连接体系为载体pNH-MS2his和NV-GI蛋白片段分别为2 yL和6 yL，T4 DNA连接酶I yL，10 X T4连接酶buffer I yL。连接产物转化DH5a感受态细胞，将涂板后获得的重组克隆进行PCR鉴定。将阳性克隆菌种送测序，鉴定为阳性的重组载体命名为pNH-MS2h i s-NV-G I (3)诱导及纯化重组pNH-MS2his-NV-GI质粒
将测序正确的pNH-MS2his-NV-GI质粒转化表达菌株BL2UDE3)，将阳性克隆菌株接种于氨苄抗性的LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D600=0.6，加入IPTG至终浓度为I mmol/L，诱导表达6 hο离心收集菌体。菌体中加入裂解缓冲液重悬，于冰上放置30min，离心去除菌体碎片，将上清加入预装有N1-NTA的纯化柱中，使液体自然流出，加入3倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤2次，然后加入洗脱缓冲液将病毒样颗粒洗脱，命名为NV-G1-VLPs。
[0014]为了检测NV，针对GI基因，本发明设计了一种鉴定引物和探针，序列如下:
正向引物 NVG1-F: 5 ’ -CGYTGGATGCGNTTYCAT-3 ’
反向引物 NVG1-R: 5 ’ -CCTTAGACGCCATCATCATTYAC-3 ’
探针NVG1-P: 5 ’ -Cy5-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-3 ’。
[0015]本发明的有益效果为:(I)高效便利:按照本发明方法能够高效、便利的得到含有NV-GI片段病毒样颗粒的标准物质(2)安全:由于病毒样颗粒不具备再复制增殖的能力和传染性，因此不会具有散毒的风险；(3)病毒样颗粒具备病毒的结构，需要进行核酸提取，因此可以对RNA病毒检测的全过程进行监控，避免了由于核酸抽提过程出现的假阴性风险；(4)病毒样颗粒具有耐RNase的优点，解决了RNA标准样品稳定性的问题。(5)该病毒样颗粒在表面人工引入了组氨酸标签，可经过亲和层系进行纯化，方便大规模推广应用。
【附图说明】
[0016]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0017]图1.NV-GI 基因片段电泳图。]?: DNA Marker DL2000； 1:阴性对照；2: RT-PCI^fe物。Marker DL2000的碱基对大小依次是2000、1000、750、500、250和 100。
[0018]图2.NV-G1- VLPs提取RNA鉴定电泳图。Marker DL2000的碱基对大小依次是2000、1000、750、500、250和100。
[0019]图3.不同保存温度NV-G1-VLPs的稳定性测试。A.4°C下保存检测B._20°C下保存检测。
[0020]图4.NV-G1- VLPs DNA荧光定量PCR检测。
[0021 ]图5.NV-G1- VLPs RNA荧光定量PCR检测。
[0022]图6.草莓浆果中NV-GI检测。
【具体实施方式】
[0023]实施例1制备NV-G1- VLPs
含有NV-GI基因的病毒样颗粒标准物质的制备方法，包括以下步骤:
(I)含有组氨酸标签的VLPs重组质粒pET-NH-MS2his的构建
将pET32a质粒使用Xba I和Nco I消化，去除其中的Xba I和Nco I两个酶切位点间的序列，将人工合成的5 ’ -P04-CTAGATTACAAGGC-3 ’ 和5 ’ -P04-CATGGCCTTGTAAT-3 ’ 两条互补的寡核苷酸复性后插入其中，构建重组质粒pET-NH，测序鉴定。
[0024]采用一步法扩增试剂盒以MS2Pfl和MS2Prl为引物，以MS2 RNA为模板扩增MS2目的片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒(TaKaRa)回收目的片段，用50yL ddH20洗脱，标记为MS2 DNA。
[0025]采用OneStep RT-PCR，以得到的MS2 DNA为模板，分别用引物MS2Pfl和ms2hispr和ms2hispf和MS2Prl扩增MS2上和MS2下2个DNA片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后，存于4°C备用。再以2个片段的混合物为模板，以MS2Pfl和MS2Prl为引物做PCR，得到引入了编码组氨酸标签序列的MS2 DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后的PCR产物命名为MS2his。
[0026]分别将制备的pET-NH载体和回收的MS2his片段用限制性内切酶BamHI和Hind ΙΠ进行酶切消化。将双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后与PET-NH载体用Solut1nI连接酶进行连接。连接产物转化DH5a感受态细胞，挑取单菌落作进行酶切鉴定。从平板培养基上挑选单菌落接种至5 ml的含有Amp抗生素的液体培养基中，37°C振荡培养12-16小时，参照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。以提取的质粒为模板，以MS2Pf和MS2Pr为引物进行PCR扩增。将PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。若可见载体与
I700 bp左右的MS2目的片段即为阳性。
[0027](2 )构建原核表达载体 pNH_MS2h i s -NV-GI
按RNA提取试剂盒说明书的方法提取NV总RNA作为模板，以NV-GIfl和NV-GIrl为引物扩增NV-GI蛋白基因，RT-PCR体系为:5XRT-PCR buffer 5yL，dNTP mix IyL,Enzyme MixIyL，引物NF和NR各IyL，RNA模板5yL，ddH20补足25 yL，反应条件为，50°C反转录30min，95°C灭火变性lOmin，然后95°C lmin，55°C lmin，72°C I min