一种植物诱导型启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物转基因技术领域，具体设及一种植物诱导型启动子序列及其在植 物抗逆调控中的应用。
【背景技术】
[0002] 盐溃化和干旱是制约农业可持续发展的重要环境因素。据统计，全世界103个国家 有盐溃化±壤，面积达38，000万公顷，约占全球可耕地面积的10% ;我国约有1.4亿亩盐溃 化耕地和4亿亩的盐溃化荒地。更为严重的是，因全球气溫升高，海平面上升，加之工业污染 和农业灌概、施肥不当等人为因素的影响，次生盐溃化±壤面积还在W每年3%的速度扩 展;加上水资源日趋紧张，干旱发生极为频繁，每年因干旱减产粮食100亿公斤W上，直接经 济损失达100-200亿元。运"双重威胁"给农业生产带来重大损失。因此，如何在高盐和干旱 等逆境条件下最大限度地发挥作物的生产潜力，是我国目前农业生产迫切需要解决的问 题。其中培育耐盐、抗旱新品种是解决农作物高盐、干旱胁迫的根本有效途径，而挖掘、研究 和利用植物中调控抗逆性的关键基因和重要调控元件是培育耐盐、抗旱新品种的重要手 段。
[0003] 植物诱导型启动子可W精细调节植物在受到外界刺激时基因的表达，诱导型启动 子的研究一直是植物转录表达调控的热点问题，特别是诱导型启动子在植物抗逆转基因育 种中作为关键元件备受关注。目前诱导型启动子主要集中在生物和非生物胁迫诱导启动子 方面，包括响应干旱、高盐、高溫、冷害、病害和外源ΑΒΑ胁迫的启动子，其中一些启动子已广 泛应用于植物抗逆转基因育种中。比如，拟南芥Rd29启动子已成功应用于抗旱转基因小麦 育种;高盐、干旱和ΑΒΑ诱导启动子0sNCED3、Wsil8已应用于水稻抗逆转基因育种。尽管目前 已克隆出一些逆境诱导型启动子，但还是不能满足不同植物不同转基因育种的要求。尤其 对于转调控基因作物育种来说，选择诱导表达活性适中的启动子非常重要。所W挖掘和研 究新的逆境诱导型启动子，特别是从特殊生境植物筛选克隆逆境诱导活性适中的启动子具 有重要价值和意义。
[0004] 蛋白激酶在植物抗逆响应中起重要信号传递作用。其中，CIPK(CBkinteracting protein kinase, CIPK)蛋白激酶是一类植物所特有的、与巧离子感受器CBLs (calcineurin B-1化e，CBL)特异作用的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。CBkCIPK-祀蛋白构成了 感知、传递和响应逆境信号的调控通路，是植物逆境调控研究的热点之一。但由于该调控途 径存在复杂性、多样性和交叉性，CBkCIPK所设及到的调控功能比预期的要复杂的多。
[0005] 迄今为止，已鉴定出的、被广泛认可的响应逆境胁迫的CBkCIPK调控途径有：响应 高盐胁迫的SOS途径、响应低钟胁迫的CBL1/邸L9-CIPK23-AKT1途径、响应高pH胁迫的CBL2-CIPK11-AHA2途径。CIPKs作为植物逆境响应信号调控途径的枢纽，在逆境信号传导中起重 要作用。但是不同的CIPK成员可能参与相同的调控途径，相同的CIPK也可能参与不同逆境 胁迫响应。到目前为止，除S0S2/AtCIPK24外，在已研究的部分AtCIPKs成员中还未见其他成 员参与拟南芥耐盐性调控。迄今，研究的材料大部分局限于模式植物或甜±植物，非特殊种 质。一些特殊生境种质材料可能具有解密逆境化2+信号的特殊途径，挖掘克隆特殊生境植物 信号组分，解析其在逆境胁迫中的作用，对有效利用基因资源改良作物抗逆性具有重要意 义。
[0006] 在解析CIPK基因功能的同时，其启动子的功能也备受关注。但是目前报道的大部 分CIPK启动子活性均表现为组织特异性，如AtCIPKl启动子、AtCIPK3启动子和AtCIPK9启动 子等，而且启动子研究多集中于模式植物，从非模式植物克隆并进行启动子功能分析的报 道较少，仅见从芥菜中分离获得的BjS0S2启动子具有逆境诱导表达活性，而且诱导表达活 性较强，对于驱动逆境胁迫响应下游基因来说，是一种比较合适的启动子，而对于调控基因 (转录因子和信号传导因子）的诱导表达来说，则需要诱导表达活性适中的启动子来驱动。 因此，逆境诱导启动子的分离与功能研究具有重要意义。
[0007] 野大麦(Hordeum brevisubulatum(T;rin.化ink)是禾本科大麦属一种多年生兼性 盐生的优良牧草，主要分布在西西伯利亚、蒙古和我国东北、华北、新疆、西藏和内蒙等省 区，是盐化和碱化草甸草原的建群种，具有显著的耐盐性，是研究植物耐盐生理和耐盐机制 的优异资源。但前人只局限在形态、解剖、生理等方面的研究，在野大麦耐盐分子机制和基 因克隆方面的研究较少。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种植物诱导型启动子，该启动子可应用于植物耐盐等抗 逆分子机理研究和农作物抗逆转基因育种。本发明的目的是通过W下技术方案实现的。
[0009] 1)或2)或3)的DNA 分子：
[0010] 1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA分子；
[0011] 2)在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列杂交且具有启动子 活性的DNA分子；
[0012] 3)与所述1)或2)的核巧酸序列具有65% W上的同一性，且具有启动子活性的DNA 分子。
[0013 ] DNA分子有关的生物材料，为下述A1) -A6)中的任意一种：
[0014] A1)含有所述DNA分子的表达盒；
[0015] A2)含有所述DNA分子的重组载体，或A1)所述表达盒的重组载体；
[0016] A3)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的重组微生物；
[0017] A4)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的重组细胞系；
[0018] A5)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的转基因植物组织；
[0019] A6)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的转基因植物器官。
[0020] 所述DNA分子在作为植物诱导型启动子中的应用。
[0021] 进一步的，所述诱导型启动子为逆境诱导型和/或ΑΒΑ诱导型启动子;所述逆境胁 迫为盐胁迫和/或干旱胁迫。
[0022] 所述DNA分子或Α1)-Α3)中任一所述生物材料在植物体内启动目的基因表达的应 用及在培育植物品种中的应用。
[0023] 一种SEQ ID Ν0.1所示的DNA分子的获得方法，包括如下步骤：1)采用CTAB法提取 野大麦基因组DNA，2)采用基因组步移法克隆野大麦化CIPK2启动子区域;步骤2)中进行两 轮PCR扩增，分别使用2条反向引物SPl和SP2,所述SPl和SP2引物分别为序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的DM分子。
[0024] -种培育转基因植物的方法，是将所述DNA分子和目的基因导入植物中，得到所述 目的基因受逆境胁迫诱导和/或ΑΒΑ诱导表达的植物。
[0025] 进一步的，所述的方法包括如下步骤：1)构建W权利要求1所述DNA分子驱动GUS 基因的表达载体pro化CIPK2: GUS; 2)利用表达载体pro化CIPK2: GUS获得转基因株系。
[00%] 进一步的，所述步骤1)的具体操作方法为:使用引物pro化CIPK2-F、pro化CIPK2-R 采用PCR方法扩增所述DNA分子并引入酶切位点Pst巧日趾〇1，测序后插入载体pYBAl 121，构 建获得表达载体pr細bCIPK2:GUS;所述引物proHbCIPK2-F、proHbCIPK2-R分别为序列表中 沈Q ID N0.4、SEQ ID ^.5所示0臟分子。
[0027]进一步的，所述步骤2)的具体操作方法为:将载体pro冊CIPK2:GUS电击转化到农 杆菌菌株，制备转化菌液，对植株进行浸染转化，收获的TO代种子在平板上筛选转化子。 [00%]本发明公开的DNA序列为来自盐生野大麦。该序列位于化CIPK2基因翻译起始位点 第1位到1750位调控区的核巧酸序列，该序列的调控元件包含有设及干旱胁迫应答、高低溫 等应答元件。该序列可被高盐、干旱和外源ΑΒΑ逆境所诱导表达，但诱导表达活性有差别，能 用于植物诱导型表达载体，在生物工程领域中具有广泛的适用性和很好的应用前景。
[0029] 本发明的有益效果为：
[0030] (1)首次从盐生种质-野大麦中分离获得化CIPK2启动子序列(DNA序列），经功能分 析证明该启动子属于典型的逆境诱导型启动子；
[0031] (2)该DNA序列的逆境诱导表达活性与化CIPK2基因在不同逆境条件下的诱导表达 结果一致，其功能阐述属于首次。
[0032] (3)该DNA序列与已报道的BjS0S2启动子在序列上完全不同，而且在功能上也不 同。后者在高盐、ΑΒΑ和干旱胁迫下诱导表达活性较强，并在高低溫胁迫下也有诱导表达活 性;该DNA序列作为启动子在高盐胁迫下诱导表达活性明显，在干旱和ΑΒΑ胁迫下诱导活性 稍弱，但不响应高低溫胁迫，说明二者