一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系的利记博彩app
【专利说明】-种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系
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技术领域： 本发明提供了一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系，可用于制备无伪狂犬病毒感染的细胞 或动物模型，同时提供了相应的制备方法，属于细胞生物学技术领域。
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【背景技术】： 伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是发生于家猪和野猪的病毒病，在世界上的大 部分地区呈地方性流行。牛、羊、猫、狗等家畜和野生哺乳动物都是易感染动物。另外，有文 献报道，该病毒还可W感染人类。
[0003] PRV属于瘤诊病毒科，与感染人类的单纯瘤疹病毒(HSV)亲缘关系较近。该病毒的 化30基因编码DNA复制酶亚基，且其基因序列在瘤诊病毒科的病毒中保守性较强。因此， 化30基因可W作为瘤诊病毒科病毒的预防及治疗的祀基因。另外，目前国内外关于猪伪狂 犬病毒的抑制细胞系的研究尚没有报道。
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【发明内容】
： 本发明公开了一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系，该细胞可W显著抑制伪狂犬病毒的感 染，可用于制备无伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型； 本发明还提供了猪伪狂犬病毒的抑制细胞系的制备方法，适用于人工制备该细胞系； 本发明提供的一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系，其特征在于： 该细胞含有化s9核酸内切酶系统和祀向PRV的化30基因的sgRNA;该细胞感染PRV后，该 sgRNA可W特异结合到化30基因的特定位点上，并准确地引导细胞内的化s9核酸内切酶系 统将化30基因特异切断，导致化30基因不能表达，从而达到抑制病毒复制的目的； 本发明公开了一种真核表达载体PX459-PRV，用于构建上述的猪伪狂犬病毒抑制细胞 系； 本发明构建的真核表达载体PX459-PRV是在PX459载体的基础上，插入人工合成的DNA 片段而成； 本发明公开的PX459-PRV上插入的人工合成的DNA片段可W在细胞内转录为sgRNA，且 该sgRNA可W特异地与PRV的化30基因的特定位点结合； 本发明公开的人工合成的DNA序列为： sgP民V-F3:5-caccgtgccgccgcagtagaccgt-3， sgPRV-民3:5-aaacacggtctactgcggcggcac-3; 本发明所述猪伪狂犬病毒的抑制细胞系的制备方法，包括W下步骤： 1. 人工合成DNA片段 sgP民V-F3:5-caccgtgccgccgcagtagaccgt-3， SgPRV-民3:5-aaacacggtctactgcggcggcac-3; 2. 真核表达载体PX459-PRV的构建 将上述合成的DNA片段经过退火后，连接到真核表达载体PX459的相应酶切位点上，构 建成真核表达载体PX459-PRV; 3. 猪伪狂犬病毒抑制细胞系的建立 将上述构建的真核表达载体PX459-PRV用Fsp I酶切线性化，转染到ΡΚ-15细胞中，对经 抗性筛选获得的阳性细胞进行鉴定，对鉴定正确的阳性细胞进行冻存； 3.1载体线性化：提取PX459-PRV质粒，用Fsp I酶切，然后乙醇沉淀，用无菌dd出0溶 解； 3.2 转染：将线性化的载体按照 TurboFect? transfection reagent (Thermo Fisher Scientific, USA)说明书转染ΡΚ-15细胞，5 % C〇2，37 °C培养； 3.3细胞系的获得:上述转染后的细胞用化ro筛选8-10天后，获得抗性细胞； 4.猪伪狂犬病毒抑制细胞系的鉴定 对上述化ro筛选获得的阳性细胞，用IFA方法进行鉴定，即得到猪伪狂犬病毒的抑制细 胞系，并命名为PX459-PRV-i细胞。
[000引IFA实验过程为:将PK-15细胞铺于24孔细胞培养皿中；细胞长满单层W后，将细胞 培养液弃掉，各孔分别用200PBS清洗3遍;之后，各孔分别加入200 |xL 80 %冷丙酬，放置-20 °C固定过夜;然后，将冷丙酬弃掉，各孔分别用200 .|_汇PBS清洗3遍，将Flag化g Antibody RalAit polyclonal(武汉Ξ鹰)进行1:500稀释(稀释液为PBS+10 % FBS)后，各孔分别加入 200 μL^，于37°C恒溫箱中解育2.5 h;弃掉一抗，各孔分别用200 PBS清洗4遍，然后各 孔分别加入200 ;鸿FITC标记山羊抗兔IgG化+L)(1:1000稀释，稀释液为PBS+10 % FBS)， 于37°C恒溫培养箱中解育1 h;弃掉二抗，各孔分别用200 pLPBS清洗4遍，最后用巧光显微 镜观察。
[0006] 本发明的积极效果在于:制备的猪伪狂犬病毒的抑制细胞系含有化s9核酸内切酶 系统和祀向PRV的化30基因的sgRNA。该细胞对PRV的感染具有显著的抑制作用。可用于制备 无伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型，在临床、实验室研究上具有广阔的应用前景。
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【附图说明】： 图1.真核表达载体PX459-PRV制备流程图； 图2.猪伪狂犬病毒的抑制细胞的巧光结果图； 图3.猪伪狂犬病毒的抑制细胞抑制PRV基因组拷贝数效果图； 图4.猪伪狂犬病毒的抑制细胞抑制PRV的TCIC50效果图； 图5.猪伪狂犬病毒的抑制细胞抑制PRV感染的IFA效果图。
【具体实施方式】
[0008] W下实施例证明本发明的效果，下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是 W任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域 普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0009] 实施例1 真核表达载体PX459-PRV的构建 1合成DNA片段 S邑PRV-F3:5-cacc邑t邑CC邑CC邑ca邑ta邑acc邑t-3, S邑PRV-R3:5-aaacac邑邑tctact邑C邑邑C邑邑cac-3。
[0010] 2实验过程(参照图1) 1) PX459-PRV的构建：用化s I酶切PX459载体，回收载体片段;将上述人工合成的DNA 片段退火后与回收的PX459载体片段连接。
[0011] 2)转化将上述连接后的载体转化大肠杆菌D册曰，获得阳性菌株。
[0012] 3结果测序鉴定，成功构建了PX459-PRV。
[0013] 4结论成功构建了用于制备猪伪狂犬病毒的抑制细胞的表达质粒PX459-PRV。
[0014] 实施例2 猪伪狂犬病毒的抑制细胞的制备 1 质粒 PX459-PRV。
[0015] 2 细胞 PK-15细胞。
[0016] 3实验过程 1)载体线性化:提取PX459-PRV质粒，用Fsp I酶切，然后乙醇沉淀，用无菌dd出0溶解。
[0017] 2)转染：将线性化的载体按照TurboFect ? transfection reagent (Thermo Fisher Scientific, USA)说明书转染PK-15细胞，5 % C〇2，37 °C培养。
[0018] 3)细胞系的获得：上述转染后的细胞用化ro筛选8-10天后，获得抗性细胞;采用 IFA法进行鉴定。
[0019] 4)阳性细胞的鉴定:对上述化ro筛选获得的阳性细胞，用IFA方法进行鉴定，得到 猪伪狂犬病毒的抑制细胞系，并命名为PX459-PRV-i细胞。
[0020] IFA实验过程为:将PK-15细胞铺于24孔细胞培养皿中；细胞长满单层W后，将细胞 培