一种用于筛选流感病毒聚合酶组装抑制剂的细胞系及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于筛选流感病毒聚合酶组装抑制剂用细胞系及其构建方法，属 于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 流感病毒是一种负链RNA病毒，能造成人类急性上呼吸道感染并能致死。季节性流 感影响世界5%-15%的人口，每年造成大约50万人死亡。流感病毒按照抗原类不同可分为 A、B、CS种血清学上差异明显的亚型，其中对人类危害最大的是甲型(A型)流感病毒，例如 高致病性禽流感册N1和H7N9，及2009年出现的化N1的流行造成大量人员死亡[1，2]。
[0003] 目前治疗流感的主要方式是疫苗和针对膜蛋白HA和M2的小分子药物。因为流感病 毒变异非常快，导致无法准确预测将要流行的病毒，因此疫苗有时会错配，导致保护效果降 低口]。
[0004] 目前治疗流感的药物按作用机制分为两类:M2离子通道蛋白抑制剂，如金刚烧胺； 和NA抑制剂，如奥司他韦、帕拉米韦、扎那米韦。M2离子通道蛋白抑制剂存在神经毒性，长期 服用易产生耐药毒株和对B型流感无效等缺陷;而NA抑制剂同样也存在耐药性问题，因此寻 找新型的抗流感病毒药物和途径势在必行[4]。
[0005] 甲型流感病毒的基因组是由8条负链RNA组成，每条病毒RNA都与核蛋白、RNA聚合 酶亚单位(PB2、PB1、PA)组合形成聚合酶复合物。其中RNA聚合酶亚单位(PB2、PB1、PA)是负 责流感病毒复制和转录的重要复合物。该Ξ聚体复合物的有效组装是流感病毒RNA复制的 限速步骤，对于流感病毒RNA的合成来说至关重要。在进化上，流感病毒聚合酶结构和功能 都非常的保守，针对流感病毒聚合酶的药物相对于针对表面蛋白的药物来讲具有更好的广 谱性和耐药性[5，6]。现在已发现有多种能抑制流感病毒聚合酶组装的多肤或小分子抑制 剂，譬如PBli-2日，PB1731-巧谱，能分别破坏PA-PB1，PB1-PB2的相互作用，小分子361能破坏PA-PB1的相互作用[7-9]。但研究运些抑制剂的方法都是采用类似CoIP，BiFC或GST pull down 等方法，比较费时费力。
[0006] 另外，天然存在的小分子种类和数量巨大，要想从运些小分子中筛选能有效抑制 流感病毒聚合酶组装的抑制剂，使用一个高效的筛选方法就很有必要。目前对流感病毒聚 合酶研究主要应用的是流感病毒聚合酶的微型复制系统一表达?82、？81、？4、肥和1?^4报告 基因的细胞。为了更高效的检测流感病毒的感染或筛选抑制流感病毒复制的抑制剂等，人 们将该RNA报告基因转到细胞中形成稳定表达细胞系。然而，目前还没有用于筛选针对流感 病毒聚合酶组装的小分子抑制剂的细胞系。
[0007] 综上所述，能用来筛选针对流感病毒聚合酶组装的抑制剂的细胞系具有广阔的应 用前景。
[000引 W上【背景技术】中提及的文献具体分别参考于W下：
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【发明内容】
[0020] 本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种筛选流感病毒聚合酶组装抑制 剂用细胞系构建方法。
[0021] 本发明的目的通过W下技术方案来实现：
[0022] -种用于筛选流感病毒聚合酶组装抑制剂的细胞系，所述细胞系为可诱导表达 PA/PB1 的 PA/PB1 293(Teton)细胞系。
[0023] -种用于筛选流感病毒聚合酶组装抑制剂的细胞系的构建方法，所述构建方法包 括如下步骤，
[0024] S1、质粒的构建:构建PA、PB1质粒;通过特异性引物将流感病毒PA、PB1基因进行扩 增，并对扩增产物进行双酶切，然后通过T4连接酶连接至载体，提取PA、PB1全长质粒；
[00巧]S2、慢病毒表达载体构建:采用Gaussia Luciferase巧光素酶作为报告基因，克隆 到慢病毒载体上；
[0026] S2、慢病毒载体构建:通过克隆技术，将构建好的PA、PB1全长质粒同源到可诱导型 的慢病毒表达载体，形成地iLC3-PA和地iLC2-PBl;
[0027] S3、稳定表达Teton-3G蛋白的293T细胞的构建:将可诱导型基因片段，其序列为 SEQIDN0:5，通过酶切连接至慢病毒载体FG上，转化至T0P10感受态细胞，标记为FG-Teton-3G，通过 pMDLg/pRRE/，pRSV-Rev，pMD2. GS 质粒系统将 FG-Teton-3G 在细胞内稳定表 达；
[0028] S4、可诱导表达PA/PB1的细胞系构建:将构建好的pBiLC3-PA和pBiLC2-PBl通过Ξ 质粒系统，使PA/PB1稳定整合在293T细胞内，最终形成可诱导表达PA/PB1的PA/PB1293 (Teton)细胞系。
[0029] 优选地，所述S1中PA、PB1基因进行扩增的条件为95°C预变性5min;再进行30个循 环，循环所遵循条件为95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸2.5min，最后采用72°C延伸 lOmin，
[0030] 用于扩增流感病毒聚合酶的特异性引物，所述特意性引物的序列为SEQ ID NO: 1、 沈Q ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4。
[0031] 优选地，所述细胞系用于筛选抑制流感病毒的聚合酶亚单元PA-PBl的相互作用的 抑制剂。
[0032] 本发明的有益效果:能高效的对能够抑制针对流感病毒聚合酶组装的抑制剂进行 筛选，W更快的找出所需的抑制剂，大大的提高了效率。
【附图说明】
[0033] 图1是?4/?81(2931'，了6扣11)细胞系中0〇义〇7(311116对?4/?81可控诱导表达影响示意 图。
[0034] 图2是本发明的细胞系检测抑制PA-PB1的相互作用的抑制剂效果示意图。
【具体实施方式】
[0035] 本发明具体掲示了一种设计特异引物将流感病毒的PA、PB1基因从模板WSN33病毒 基因中扩增，所述扩增条件为95°C预变性5min;再进行30个循环，循环所遵循条件为95°C变 性30s，56°C退火30s，72°C延伸2.5min，最后采用72°C延伸lOmin。W上所述引物序列见表1。
[0036] 表1:引物序列表
[0037]
[003引用Notl、AscI (购自肥B公司）双酶切PCR产物和pEnt巧载体（购自Invitrogen公 司），用T4连接酶(购自肥B公司）连接片段到祀ntry载体上，测序鉴定正确后提质粒保存。 [0039] BiLC(双分子巧光素酶互补测定)慢病毒表达载体的构建
[0040] BiLC目piBimole州le Luminescence Complementation(双分子巧光互补）的缩写， 相对于 BiFC(BimoleculeFluorescenceComplementation)区别是前者使用Luciferase作 为报告基因，后者用GFP或YFP等巧光蛋白作为报告基因[10，11 ]。由于Lucif erase是酶催化 的化学发光反应，灵敏度比GFP单纯的激发发光要高很多，使得BiLC方法的灵敏度都比BiFC 高很多。
[0041 ] 首先，将Gaussia luciferase从109位氨基酸的位置分为N端和C端，并将N端的16 个