一种四分支多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生命科学技术领域，尤其涉及一种四分支多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤发病率从有癌症记录以来，一直呈上升的趋势，特别是过去二三十年以来，月中 瘤发病以每年在3 %到5 %的速度在提高，而且在提高当中80 %新发肿瘤发生在发展中国 家。目前全世界每年新发肿瘤约1300万，当年死亡病例达到800万，而我国每年新增患者约 250万，死亡近180万。最近的流行病学调查显示，癌症已成为我国主要大中型城市的第一死 亡原因。手术、放疗以及化疗仍是目前肿瘤治疗的主要手段，但手术对中晚期患者疗效差， 而放化疗由于其副作用大，对目标的选择性不高等都显示出传统治疗方式的局限性。
[0003] 常用的疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗。目前的亚单位疫苗多是采 用重组DNA技术用微生物或哺乳动物细胞产生。但分子量较小的抗原很难用重组DNA技术制 备，化学合成便成为较为简便的途径。合成肽疫苗是根据抗原的氨基酸序列设计的用化学 方法合成的一种安全性很高的疫苗，但其分子量小、免疫原性弱并且仅针对单一的抗原表 位，这使其应用受到限制。将合成肽疫苗与其它载体蛋白偶联虽然能提高前者免疫原性，但 因为引入了无关蛋白，无法估计其对目标抗原肽结构的影响，所以效果仍不理想。分支状多 抗原肽系统通常是指利用赖氨酸(Lys)的两个氨基分别能与另一个氨基酸的羧基形成肽键 这一特征，以数个Lys(n)作为核心。将多条相同或不相同的抗原肽连接，通过化学合成方法 制备的大分子分支状多肽。多抗原肽(Multiple antigen peptides,MAP)最先由James PT 在1988年提出，这一系统能在不引入其它蛋白质的情况下，解决合成的抗原肽疫苗免疫原 性弱的困难。James在研究中还发现，MAP能明显增加线性抗原肽的免疫原性，其诱导家兔产 生的抗体水平明显高于单拷贝短肽和偶联至琥珀酰化钥孔血蓝蛋白（Keyhole limpethemocyanin，KLH)载体的肽。此后，很多人尝试采用MAP的技术研制针对多种疾病的 疫苗。天然抗原不仅含有B、T细胞表位和M H C限制性表位等有利于免疫识别和应答的表 位，同时还含有不利于免疫反应、甚至导致免疫耐受的优势非中和表位或抑制性表位等。人 工合成的疫苗可根据需要选择有利于免疫应答的表位，避开不利于免疫应答的表位，在保 持抗原特异性的基础上诱导特定的免疫应答。将选择的表位制备成分支状多抗原肽，一方 面能增加其免疫原性，另一方面还能将不同的表位组合在同一个MAP上以更好发挥疫苗的 功能。
[0004] 疫苗保护效果的优劣很大程度上取决于其中能刺激机体免疫系统的抗原表位。构 建MAP疫苗时常选择的表位有以下几种:MAP最常选择的抗原表位是特异性激活机体体液免 疫的Th细胞表位或B细胞表位。近年研究发现，Th细胞表位和B细胞表位在蛋白分子上的同 时存在能够有效刺激机体产生免疫反应。因为Lys分支状骨架连接的多个抗原肽可以相同， 也可以不同，所以MAP疫苗可以满足这一要求。这一优势在疟疾疫苗的研究中得到运用。将 疟原虫生活史不同时期的三种特异性蛋白的抗原表位组合到一个MAP疫苗中，组成由两个T 细胞表位和一个B细胞表位的MAP疫苗，可诱导机体产生特异性抗体，从而有效激活体液免 疫反应。刺激机体细胞免疫的MHC分子特异性识别的细胞毒性T细胞(CTL)表位。CTL是抗病 毒免疫的主要成分之一，虽然不能预防病毒感染，但可以清除已感染的细胞，并通过细胞因 子限制病毒的复制。PRLla是鼠白血病肿瘤排斥抗原中被CTL识别的短肽，采用八拷贝pRLla 作为肿瘤候选疫苗免疫小鼠，致敏小鼠的脾细胞发生了CTL反应，并明显抑制肿瘤生长。位 于抗原分子空间构象隐蔽处的表位，通常不易被APC识别并呈递，因而无法刺激免疫系统。 通过单独合成这些抗原表位，合成肽疫苗能打破这种结构性限制。一项关于HIVMAP位，其中 两个表位源于gpl20蛋白桥联片(Bridgingsheetregion)结构，另一个表位参与构成CD4+分 子结合部位，这三个表位都位于天然gp 120蛋白分子的内部，天然感染时均无法激活机体免 疫系统，但化学合成由这三个表位构成的MAP在小鼠体内诱导了能与gp 120结合的高效价抗 体。
[0005] 免疫治疗作为一种新的肿瘤治疗方式，由于其特异性强，选择性高，毒副作用小， 越来越受到学者和患者的欢迎。其中以TAA结合DC为基础的肿瘤治疗方式。但目前发现的肿 瘤相关抗原大多具有组织特异性，如AFP只针对肝癌等，以这些抗原来进行免疫治疗，只能 对相应的肿瘤起作用，限制了以这些抗原为靶标的肿瘤疫苗的广泛应用。
【发明内容】
[0006] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种广泛适用于多种肿瘤治疗和免 疫的四分支多肽。
[0007] 本发明提供了一种四分支多肽，结构式为：
[0009] 上述的四分支多肽的四个分支中的氨基酸序列均可以置换成S0X2或0CT4其他段 的氨基酸肽链。本发明的一种人工合成的功能性四分支多肽产物，（AA 1-AA2)2-(Lys - 順2)2-Lys-SER-NH2,其中ΑΑι、ΑΑ2分别为S0X2和0CT4的15个AA的肽段。S0X2和0CT4是一种 基因转录调节因子，即使是癌细胞中，表达水平也是在具有干细胞样特征的癌干细胞中特 别高。S0X2和0CT4在肺癌、肾癌等多种癌中表达，在正常组织中的表达仅限于胚性干细胞和 神经干细胞等中。所以应用S0X2和0CT4作为抗原诱导形成的CTL可以对多种肿瘤起作用，从 而得到广泛引用。本制备本发明的四分支多肽时，选取S0X2和0CT4表位中AAl、AA2段设计其 MAP结构，采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成法在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自 多肽的羧基端(C)向氨基端(N)合成四分支多肽，反应完成后得到的肽树脂采用TEA法将多 肽从树脂上裂解下来。。
[0010] 进一步地，本发明还提供一种能够编码如权利要求1或2所述四分支多肽的DNA序 列。
[0011]更进一步地，本发明还提供一种细胞毒性T细胞，由上述的四分支多肽诱导而得 到。
[0012]另一方面，本发明提供上述的四分支多肽、相应的DNA以及相应的CTL细胞相关的 应用，具体为：
[0013] 上述的四分支多肽在制备提高机体免疫能力药物或试剂盒中的应用。
[0014] 上述的四分支多肽在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
[0015] 上述四分支多肽相对应的DNA在制备提高机体免疫能力药物或试剂盒中的应用。
[0016] 上述四分支多肽相对应的DNA在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
[0017] 上述相应的细胞毒性T细胞在制备提高机体免疫能力药物或试剂盒中的应用。
[0018] 上述相应的细胞毒性T细胞在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
[0019] 本发明的分支多肽合成产物具有综合提高机体免疫原性和延长其半衰期的功效， 在制备抗肿瘤的药物或疫苗中具有广泛的应用前景。同时，本发明的四分支多肽在应用于 抗肿瘤疫苗制备时，与全基因序列腺病毒负载DC疫苗相比，由于多肽疫苗没有腺病毒载体 的参与，不必考虑载体及其整合的安全性，也不必考虑全长蛋白中某些非优