一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的引物对的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及男性不育症检测领域，尤其涉及一种检测与特发性无精子症相关的遗 传标记的引物对。
【背景技术】
[0002] 全球约有10%~15%的育龄夫妇面临不能生育的问题，其中一半是由于男性不 育。原发性无精子症是造成男性不育的一个非常重要的原因，约影响1%的成年男性。男性 不育发病因素具有复杂性和多样性的特点，包括疾病、营养不良、内分泌紊乱、基因缺陷和 环境因素等，其具体发病机制尚不明确，但从家族病例报道和小鼠模型的研究成果中可以 推断遗传因素起了很大作用。近年来，随着现代分子生物学技术的发展，人们已发现近200 个基因与男性不育症的发生密切相关;采用基因敲除技术，发现近400个基因与小鼠精子发 生密切相关，这些基因的突变、缺失或表达异常，可能是男性不育症发生的重要原因。对这 些突变基因的研究将有助于男性不育症的诊断，也有助于将来在体外受精过程中防止将遗 传缺陷带给下一代。
[0003] 雄激素受体(AR，NCBI Gene ID: 367)是一种重要的类固醇激素受体，在男性性分 化和维持正常精子发生过程中发挥关键作用。AR属于核转录因子调控的类固醇激素作用的 家族。AR有4个蛋白结构，包括N末端反式激活结构域(NTD)，DNA结合域(DK))，铰链区(HR)和 羧基配体结合域(LBD)。它能结合雄激素，包括睾酮(T)和5α_二氢睾酮(DHT)的配体结合域， 从而介导核易位和AR的转录调节功能。
[0004] 在过去的几年中，确定了一些AR突变或多态性，可以导致或与遗传疾病相关，如完 全或部分雄激素不敏感综合征(CAIS和PAIS)。然而，还需要深入地研究以揭示AR突变与特 发性无精子症(IA)的关系，为特发性无精子症的诊断提供依据和指导。
【发明内容】
[0005] 为了确定IA患者AR基因突变的情况，我们将776例IA患者和709例正常生育男性的 AR基因外显子测序，首次新发现5个错义突变和1个同义突变与IA的发生相关。
[0006] 基于本发明的发现，本发明提供一种与特发性无精子症相关的遗传标记，其位于 AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其中，上述序列的突变位点选自 c · 868T>C、c · 1484G>A、c · 1888C>T、c · 569C>T、c · 616A>G和c · 1149C>T中的一个或多个。
[0007] 前5个突变位点是错义突变，第6个突变位点是同义突变。
[0008] 上述突变分别是在如SEQ ID NO: 1所示的AR基因序列的编码区的第868位、1484 位、1888位、569位、616位、1279位和 1149位。
[0009] 前5个突变位点依次分别对应的氨基酸变化情况是p.C290R、p.S495N、p.R630W、 p. T1901和p. S206G，即第290位氨基酸由C变为R、第495位氨基酸由S变为N、第630位氨基酸 由R变为W、第190位氨基酸由T变为I、第206位氨基酸由S变为G。第6个突变位点没有对应的 氨基酸变化。
[0010] 作为本发明的优选方案，上述序列的突变位点选自c.868T>C、c.1484G>A和 c. 18880T中的一个或多个。
[0011] 作为本发明的优选方案，上述序列的突变位点选自c. 18880T。
[0012] 本发明还提供一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的引物对，其中，该遗 传标记位于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，其中，上述序列的突变位 点选自 c · 868T>C、c · 1484G>A、c · 1888C>T、c · 569C>T、c · 616A>G和c · 1149C>T中的一个或多 个;上述引物对的上游引物和下游引物分别位于上述突变位点的上游和下游。
[0013] 作为本发明的优选方案，上述引物对选自primer l、primer 2或primer 3引物对， 其中，
[0014] 上述primer 1引物对的上游引物的序列如SEQ ID N0:2所示，其下游引物的序列 如SEQ ID N0:3所示；
[0015] 上述primer 2引物对的上游引物的序列如SEQ ID N0:4所示，其下游引物的序列 如SEQ ID N0:5所示；
[0016] 上述primer 3引物对的上游引物的序列如SEQ ID N0:6所示，其下游引物的序列 如SEQ ID N0:7所示。
[0017] 作为本发明的优选方案，上述序列的突变位点选自c.868T>C、c.1484G>A和 c. 18880T中的一个或多个。
[0018]作为本发明的优选方案，上述序列的突变位点选自c. 18880T。
[0019] 通过大规模测序在特发性无精子症病人中筛选出了 AR基因的6个新的突变位点， 构建AR基因野生型及突变体表达质粒转染到细胞内进行研究，通过实验发现其功能有明显 差异，表明AR基因的上述突变可能导致特发性无精子症的发生，从而能够通过上述突变来 实现对男性不育症(尤其是特发性无精子症)的诊断检测。本发明在突变位点的上游和下游 分别设计上游引物和下游引物用于检测上述突变位点，实现特发性无精子症的诊断检测。
【附图说明】
[0020] 图1为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点测序图谱；
[0021 ]图2为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点影响的进化保守性的氨基酸；
[0022]图3为在AR基因上发现的3个IA病人特异的错义突变的位置；
[0023] 图4为3个AR突变体对下游靶基因 MMTV表达的影响，NC表示阴性对照，WT表示野生 型。
【具体实施方式】
[0024]下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0025] 1实验内容
[0026] 1.1标本的收集
[0027]本申请人从2007年6月到2011年10月共收集1880例无精子症病人，其中特发性无 精子症病人为776例，我们的筛选标准为：1)随机检查三次精液中无精子;2)生殖系统或盆 腔无阻塞、炎症和损伤;3)无核型异常和Y染色体微缺失，另将709例正常可育男性(至少育 有一个孩子且未行IVF、ICSiaMSI等人类辅助生殖技术)作为对照进行研究。每例受试者均 认真签署知情同意书，本次研究通过医院伦理委员会的审查批准。
[0028] 1.2外显子测序
[0029]抽取外周血提取基因组DNA，用枸橼酸钠抗凝管收集研究对象的外周血，迅速置 于-80°C冰箱中备用，用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取外周血DNA。
[0030] 取出5微克基因组DNA送华大基因研究中心（深圳）进行外显子捕获、测序，在特发 性无精子症患者中筛选出AR基因中的9个突变位点中，其中7个错义突变和2个同义突变，与 dbSNP135数据库、千人基因组数据库和ExAC数据库中的数据相比对，有5种错义突变和1个 同义突变是我们首次发现的新突变。
[0031] 1.3验证错义突变
[0032]以提取的外周血基因组DNA为模板，使用设计合成的3对引物对仅在特发性无精子 症患者(W320，W691，W530)AR基因存在的3个错义突变位点（c. 868T>C、c. 1484G>A和c. 1888C >T)进行特异性扩增，AR序列从NCBI数据库中查得(NCBI Gene ID:367)<^|**Invitrogen 公司合成，所合成的3对引物对见表1。
[0033] 表1 AR突变位点验证引物 [0034]
L〇〇35J PCR 扩增条仵为：98X：m 变性 2min，然后以 98X：10s、6(rC：30s、72X：45s 进仃 35 个循 环，最后72°C延伸5min。
[0036] DNA电泳:取3μ1的PCR产物在1 %琼脂糖凝胶孔中，140V电泳，15min，紫外凝胶成像 系统拍照观察电泳图，确保单一条带，其余PCR产物送上海英潍捷基公司测序，引物对 Primerl、Primer2和Primer3扩增到的PCR产物片段序列分别如序列表中SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10所示。
[0037] 1.4AR突变体表达质粒的构建
[0038] 以pcDNA3 · l_AR(Mou L等人，Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells .Bio IReprod. 2013Aug 15;89(2) :32.)为模 板，使用设计合成的3对点突变引物，构建AR的3种突变体表达质粒。引物由Invitrogen公司 合成，所合成的3对点突变引物见表2。
[0039] 表2 AR 3对定点突变引物 [0040]
[0041 ] 1.5双荧光素酶报告基因实验
[0042] 1.5.1质粒准备
[0043] 野生型AR表达载体:pcDNA3.1-AR WT(WT组）
[0044] 突变型AR表达载体:pcDNA3.1-AR C290R(C290R组）
[0045] pcDNA3.1-AR S495N(S495N组）
[0046] pcDNA3.1-AR R630W(R630W组）
[0047] 1 · 5 · 2HeLa 细胞培养
[0048] 将HeLa细胞用含10 %胎牛血清DMEM培养基在37°C、5 %⑶2和95 %湿度条件下培 养。贴壁细胞在长满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶消化后按比例进行传代培养。
[0049] 1.5.3HeLa细胞瞬时转染
[0050]将HeLa