结合人类补体因子c2的结合分子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫/生物化学领域。本发明涉及用于抑制补体系统的经典激活途径 和凝集素激活途径的活化的手段和方法，及其在治疗人类病症中的应用。本发明涉及补体 因子的抑制因子及其应用。本发明具体涉及与人类补体因子C2结合的结合分子，及其在治 疗或预防补体活化介导的疾病或障碍(诸如抗体介导的炎症性疾病和缺血性病症中的缺 血-再灌注(I/R)损伤）中的应用。
【背景技术】
[0002] 补体系统包括在血液中循环的蛋白。补体因子作为无活性的前体蛋白进行循环。 所述系统的活化导致活化级联，其中，通过级联中进一步下游的补体蛋白的特异性蛋白水 解作用，一个因子活化随后的因子。补体系统属于所谓的血浆级联系统。补体系统参与宿主 针对入侵微生物的防御。
[0003] 可经由三种途径发生补体系统的活化:经典激活途径、凝集素激活途径和替代激 活途径。每一条途径都活化核芯组分C3或第三补体因子，这使得引起膜攻击复合体的形成 的常见末端途径活化(]^111161^&61'11&1(1，41111111^￥13;[001161111988,57:321)。在补体活化过 程中，生成几种炎症性肽(如过敏毒素 C3a和C5a)，以及膜攻击复合体C5b-9。这些活化产物 激发多效的生物效果，诸如白细胞的趋化性，吞噬细胞、肥大细胞和嗜碱粒细胞的脱粒，平 滑肌收缩，脉管渗透性升高，和细胞裂解(Hugl i，Complement 1986，3:111)。补体活化产物 尤其通过吞噬细胞，还诱导有毒的氧自由基的生成，以及花生四烯酸代谢物和细胞因子的 合成和释放，这进一步放大炎症应答。
[0004] 尽管补体是针对病原微生物的防御的重要线路，它的活化也可能伤害其他健康的 宿主细胞。补体介导的组织损害在很多炎症性疾病中都起作用，这些炎症性疾病包括败血 症、免疫复合体病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和脉管炎、多发性创伤、几种神经病 (诸如多灶性运动神经病）、缺血-再灌注（I/R)损伤(诸如在心肌梗塞等的过程中出现的缺 血-再灌注（I/R)损伤）。补体活化在这些病症中的致病作用是它的活化产物的上述一种或 多种生物效果的结果。因此，抑制补体活化在这些病症中是有利的。
[0005] 可通过天然抑制因子，抑制补体的活化，其中天然抑制因子在上述级联的几个水 平上控制活化。这些抑制因子包括:C1_抑制因子，其抑制经典激活途径和凝集素激活途径 的活化的早期步骤;Η因子和C4结合蛋白，其分别使C3-转化酶和C4-转化酶解离，并且充当 降解C4b和C3b的I因子的辅因子;发挥与Η类似功能的调节膜蛋白CR1、DAF和MCP;以及，抑制 MAC的血衆蛋白玻连蛋白和凝聚素（clusterin)和膜蛋白CD59(Sahu et al.，Immunol Resl998，17:109;Campbell et al.，Annu Rev Immunoll988,6:161)。
[0006] 抑制补体活化是一有吸引力的治疗选择。实际上，已经生产出几种作为重组蛋白 的内源性可溶的补体抑制因子(C1-抑制因子;可溶的补体受体1或sCRl)，并且在临床研究 中进行了评价。另外，还评价了抑制级联反应中诸如C5的关键蛋白（Thomas et al.，Mol Immuno 1 1 996，33 : 1 389 )的抗体的给药。一种这样的抗体，Solirisg).或依库丽单抗 (eculizumab)，是抗C5的抗体。目前已批准使用所述抗体来治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿 症和非典型溶血性尿毒综合征。
[0007] 补体的作用是促进对入侵微生物的吞噬作用。因此，抑制炎症性疾病中的补体具 有提高感染风险的固有缺点。凝集素激活途径和替代激活途径的补体活化可通过微生物直 接活化，而经典激活途径通过与诸如微生物的抗原结合的IgG或IgM抗体活化。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种与人类补体因子C2结合的结合分子。在一个实施方式中，所述 结合分子包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区：
[0009] (a)所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序 列：SEQIDN0:2和SEQIDN0:3 ;SEQIDN0:2和SEQIDN0:96;SEQIDN0:10和SEQID N0:11 ;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQIDN0:27;SEQIDN0:97和SEQ ID N0:27; SEQ ID N0:34和SEQ ID N0:35;或者，SEQ ID N0:98和SEQ ID N0:35;或者
[0010] (b)所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序 列：SEQIDN0:99和SEQIDN0:103 ;SEQIDN0:99和SEQIDN0:104;SEQIDN0:99和SEQ IDN0:105 ;SEQIDN0:9^PSEQIDN0:106;SEQIDN0:10(^PSEQIDN0:103;SEQIDN0: 100和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:105;SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:106; SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:103;SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:101和SEQ IDN0:105;SEQIDN0:101和SEQIDN0:106;SEQIDN0:102和SEQIDN0:103 ;SEQID NO:102和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:105;或SEQ ID NO:102和SEQ ID NO: 106;或者
[0011] (c)所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区包括在(a)和/或(b)中 具体限定的氨基酸序列，但是其中，所述序列中的一个或两者包括1~5个氨基酸替换。
[0012] Olglesby等人(J Immunol 1988,2:926)描述了一种C2特异性抗体。使用去糖基化 且变性的C2免疫小鼠，来鉴定出抗体。使用天然糖基化的C2进行免疫不产生适当的C2特异 性抗体。US2001/0026928中也记载了一种C2特异性抗体。其中开发的抗体针对C2的C2a亚组 分。其中没有公开所述抗体所识别的表位的进一步细节。
[0013] 本发明的结合分子在结合在C2上的表位是不同的。在本发明之前，并不知晓在C2 上存在更多失活表位。
[0014] 本发明的结合分子抑制补体活化，并且可用于治疗多种疾病。本发明提供了一种 预防或治疗由补体活化介导的疾病，所述方法包括将本发明的结合分子对有需要的个体给 药。本发明进一步提供本发明的结合分子，用于预防或治疗由经由经典激活途径和/或凝集 素激活途径的补体活化介导的疾病或障碍。
[0015] 这样的疾病的实例是炎症性疾病、神经疾病或缺血-再灌注（I/R)损伤。在本发明 的上下文中，优选的神经疾病是神经-炎症性疾病。本发明的结合分子不完全抑制补体。它 至少留下补体系统的一些能力，以抵御微生物入侵。本发明的结合分子至少使替代的补体 活化途径保持基本完整。本发明的结合分子这一特征普遍改善了本发明的补体抑制因子， 尤其是基于补体抑制因子的抗体的治疗适用性。根据本发明的治疗的优选实例是肾同种异 体移植的抗体介导的排斥、特发性膜性肾病、免疫溶血性贫血、免疫复合体病、缺血-再灌注 病症(诸如缺血-再灌注损伤）。本发明的结合分子是用于多种治疗性干预的有吸引力的选 择，因为它们有效限制体内补体系统的活性的结果，同时降低由于对微生物感染和/或增殖 的敏感性而产生的副作用的风险。
[0016] 在一个实施方式中，本发明的结合分子与C2a结构域的表位结合。本发明的C2a结 合分子有效抑制C2。尽管事实是这样的结合分子不完全抑制C1的剪切，但令人惊奇地是，它 们仍然是有效的。本发明的C2a结合分子使C2b与C4b的结合保持完整。尽管如此，本发明的 C2a结合分子显著抑制了 C2的活性。
[0017] 在一个实施方式中，本发明的结合分子与C2b结构域的表位结合。尽管事实是这样 的结合分子不完全抑制C1的剪切，但它们仍然是有效的。本发明的C2b结合分子使C2a与C4b 的结合保持完整。尽管如此，本发明的C2b结合分子显著抑制了 C2的活性
[0018] 在优选的实施方式中，本发明的结合分子与部分存在于C2a结构域上且部分存在 于C2b结构域上的表位结合。本发明的结合分子与单独的C2a和C2b结构域可检测地结合。尽 管事实是本发明的这样的C2a/C2b结合分子不完全抑制C1剪切，但令人惊奇地是，它们仍然 是有效的。尽管如此，本发明的C2a/C2b结合分子显著抑制了 C2的活性。
[0019] 本发明的结合分子优选是Fab片段、单链Fv(SCFv)片段，或抗体或其抗原结合片 段。
[0020] 如本文所使用的，术语"包括重链可变区和轻链可变区的结合分子"涵盖但并不限 于，抗体及其抗原结合片段。优选片段是Fab片段、scFv片段、单价抗体(unibody )、双价抗 体、三价抗体等。
[0021] 本发明的结合分子与人类C2结合。在SEQ ID:N0 1中给出了优选的人类C2的氨基 酸序列。结合分子优选与人类C2特异性结合。这意味着，在天然人的样品中，优选在人类血 浆的样品中，结合分子结合超过95 %、优选超过99%的人类C2，并且与血浆中的其他的人类 蛋白相比，对C2具有20nM或更小的亲和性。
[0022] C2的活化涉及蛋白剪切成较小的片段。通常将这些片段称为C2a片段和C2b片段。 在本发明中使用的术语是，C2a片段是较大的约70kDa的片段。C2a片段与C4b形成复合体，从 而形成C3-转化酶C4bC2a。这一复合体典型地是表面结合的。较小的约30kDa的N-末端C2b释 放到流体相中。
[0023] 如在本文中使用的，术语"C2活性"或诸如此类的描述指C2蛋白在补体活化级联中 的作用。当C2蛋白通过被C1进行蛋白剪切而活化，从无活性的前体酶转变成有活性的丝氨 酸蛋白酶时，C2蛋白是"有活性的"。有活性的C2与C4b作为辅因子能活化C3,而与C4b和C3b 作为辅因子能活化C5。
[0024] 如在本文中使用的，术语"C2抑制"或诸如此类的描述也指其在补体活化级联中的 作用。当C2活化信号（即C1)存在于它的环境中时，C2蛋白不执行其在级联中的作用以活化 补体时，C2蛋白被"抑制"。
[0025] 术语"抗体"指单克隆抗体和多克隆抗体。可从动物的血液制备抗体。目前，更普遍 是通过细胞来制备抗体，其中由所述细胞中的核酸表达该抗体。有可使用的多种细胞和细 胞系。杂交瘤细胞系普遍用于生产鼠类的单克隆抗体。随着重组DNA方式的到来，现今普遍 使用细胞系。优选的细胞系是PER. C6细胞系、CH0细胞系和NS0细胞系。上述抗体可以是单价 抗体、四价抗体或其他的多价抗体。典型地，上述抗体是如上所示的包括C2抗原结合位点的 单价抗体。
[0026] 在一个实施方式中，本发明的抗体是多特异性抗体。原型多特异性抗体是双特异 性抗体。多特异性抗体包括两个或更多个不同的抗原结合位点。在这样的多特异性抗体中， 本发明的结合分子提供抗原结合位点中的至少一个。至少一个其他的抗原结合位点是直接 针对C2上的不同表位的抗原结合位点，或者优选地，直接针对不同分子上的表位的抗原结 合位点。其他抗原结合位点优选是抗体可变区。本发明的双特异性抗体包括本发明的结合 分子，和对C2上的另一表位或不同分子上的表位具有特异性的至少一个其他的抗体可变区 (重链和轻链）。
[0027] 抗原结合片段(Fab片段)是抗体的与抗原结合的片段。它由所重链和轻链的每一 个的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。这些结构域形成抗原结合位点。两个可变结 构域与其特异性抗原上的表位结合。可在实验室中生成Fab片段。目前，可提供的有多种酶， 从抗体上切出所述片段。在本发明中，术语Fab片段涉及单一的可变结构域Fab片段和含有 两个可变结构域的F(ab'）2片段。术语Fab片段用于表示抗体分裂时的片段，以及由细胞表 达，从一个或多个编码区直接产生类似的片段。
[0028] 如本文所使用的，术语"单链Fv"（也称为scFv)指，通过分离结合抗体的结合结构 域(重链和轻链），并且补充允许保持结合功能的连接部分的经改造的抗体。这基本上形成 极端缩小的抗体，仅具有结合抗原所需的超变结构域的一部分。在例如US专利号4，946，778 (Ladner et al)中记载了单链抗体的测定和构建。
[0029] 如本文所使用的，术语"KD" (M)用于指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
[0030] 分别具体为SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的重链可变区和轻链可变区，是抗体 5F2.4的重链可变区和轻链可变区。分别具体为SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11的重链可变 区和轻链可变区，是抗体13的重链可变区和轻链可变区。分别具体为SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的重链可变区和轻链可变区，是抗体32的重链可变区和轻链可变区。分别具体为 SEQ ID N0:26和SEQ ID N0:27的重链可变区和轻链可变区，是抗体35的重链可变区和轻链 可变区。分别具体为SEQ ID N0:34和SEQ ID N0:35的重链可变区和轻链可变区，是抗体60 的重链可变区和轻链可变区。具体为SEQ ID N0:96的轻链可变区，是抗体5F2.4的轻链可变 区的小鼠共有氨基酸序列。具体为SEQ ID N0:97的重链可变区，是抗体35的重链可变区的 小鼠共有氨基酸序列。具体为SEQ ID N0:98的重链可变区，是抗体60的重链可变区的小鼠 共有氨基酸序列。SEQ ID N0:99-102是5F2.4的人源化轻链可变区VL1-4的氨基酸序列。SEQ ID N0:103-106是5F2.4的人源化重链可变区VH1-4的氨基酸序列。SEQ ID N0:107-110是编 码含人源化￥1^1，1^4的人源化1〇轻链5?2.4的〇0嫩序列(^〇10勵 ：111-114是编码含人源化 VH1-VH4的人源化IgG4链5F2.4的cDNA序列。SEQ ID N0:115-118是编码含人源化VL1-VL4的 人源化κ轻链5F2.4的氨基酸序列。SEQ ID N0:119-122是编码含人源化VH1-VH4的人源化 IgG4链5F2.4的氨基酸序列。
[0031] 本发明的结合分子中的免疫球蛋白的轻链可变区或重链可变区可具有:有1~5个 氨基酸替换的SEQ ID 勵：2、3、10、11、18、19、26、27、34、35、96-106和115-122的氨基酸序 列。具有上述经替换的重链可变区、经替换的轻链可变区或两者的本发明的结合分子，在种 类上(但不必在数量上)具有相同的C2抗原结合特征。所述结合分子结合至与原始结合分子 相同的表位。1~5个氨基酸替换能生成结合分子的去免疫化形式。典型地，可通过对重链的 最多5个位置、轻链的最多5个位置或两者进行改变，来实现用于人类受试者的去免疫化。鼠 类可变区的去免疫化是已建立好的技术，总是产生在人体内诱导免疫应答的可能性减小的 结合分子。实现这一结果所需的氨基酸替换的数量典型地在每一条链中小于5。与未经改变 的序列相比，每一条链中1、2或3个氨基酸替换常常就足以获得本发明在人体内诱导免疫应 答的可能性减小的结合分子。
[0032]在优选的实施方式中，本发明的抗体是人类抗体或人源化抗体。如本文所使用的， 术语"人类抗体"用于包括，具有来源于人种系的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗 体。人类抗体可包括，不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外的随 机或位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入突变。
[0033] 如本文所使用的，术语"人源化抗体"指免疫球蛋白或经改造的抗体构建体的构架 区的至少一部分来源于人类免疫球蛋白序列。应当清楚的是，可使用使抗体或抗体构建体 人源化的任意方法，例如通过可变结构域的表面重塑(resurfacing) (Roguska et al.， Proc Natl Acad Sci U S A1994,91:969)或CDR嫁接或重构（Hurle et al.，Curr Opin Biotechnol 1994，5 :428)。在别的人类抗体构架背景中，人源化抗体优选包括抗体5F2.4、 13、32、35或60的⑶R区。因此，本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具有SEQ ID N0:4-6的CDRl-3序列的人类重链可变区，和具有SEQIDN0:7-9的CDRl-3序列的人类轻链 可变区。当然嫁接的⑶R序列被适当放置，即SEQ ID NO:4的重链可变区的⑶R1区代替人类 抗体的重链可变区的⑶R1区，用于嫁接加工。SEQ ID N0:5的⑶R2区代替所述人类抗体的重 链可变区的CDR2区，等等。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具有SEQ ID N0: 12-14的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID勵:15-17的0?1-3序列的人类轻链 可变区。CDR区再次被适当放置。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具有SEQ ID NO:20-22的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID NO:23-25的CDR1-3序列的人 类轻链可变区。CDR区再次被适当放置。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具 有SEQ ID N0:28-30的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID N0:31-33的CDR1-3序 列的人类轻链可变区。CDR区再次被适当放置。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体 包括具有SEQ ID NO:36-38的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID NO:39-41的 CDR1-3序列的人类轻链可变区。CDR区再次被适当放置。
[0034] 在优选的实施方式中，在包括抗体5F2.4的CDR的人类抗体中，人源化轻链可变区 包括任选经1~5个氨基酸替换的SEQ ID N0:99、100、101或102的序列。在优选的实施方式 中，在包括抗体5F2.4的CDR的人类抗体中，人源化重链可变区包括任选经1~5个氨基酸替 换的SEQ ID从):10