一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测引物及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产品生物检测技术领域，特别涉及一种水产品中副溶血性弧菌和霍 乱弧菌的双重LAMP检测引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，已成为重大的 世界性公共问题，而病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)在世界范围内 被公认是两种重要的肠道致病菌。前者广泛存在于海洋环境中，是威胁海水养殖业的主要 病原菌之一，能够感染鱼、虾和贝类等，引起虾红体病、鱼类皮肤溃疡等疾病，对水产养殖业 造成重大经济损失。人类食用该菌污染的海产品后可引起食物中毒，会有腹泻、恶心、呕吐、 发热，甚至脱水、昏迷等症状，严重的可导致败血症甚至死亡，是日本、欧美和东南亚国家食 物中毒和急性腹泻病的重要病原菌。霍乱弧菌是环境水体自然菌群中的一种，霍乱弧菌中 的01群和0139群菌株可以引起很严重的人类腹泻病，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水若 抢救不及时，病死率较高，属于国际检疫传染病，在我国被列为甲类传染病。近年来，食用鲜 活海产品的人群和地域在不断增多，由此两种病原菌引发的食品安全问题也显得越来越重 要。
[0003] 鉴于其高度危害性，我国对人工养殖及海捕水产品中这霍乱和副溶血性弧菌有着 严格的限量要求。目前我国用于检测食品中这两种菌的国家标准和行业标准，皆属于传统 的培养及生化鉴定方法，检测周期长、工作量大，不能满足水产品质量安全快速反应体系的 需求。LAMP作为一种新的核酸扩增技术，较其它分子生物学检测方法而言具有实验条件低、 灵敏度高和特异性强等优势，在微生物的检测中受到青睐并推广应用。该技术在食源性致 病菌的检测中已有初步研究，但都是采用单一检测，耗时长，检测成本高。同时检测副溶血 性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP体系未见报道。若采用多重LAMP体系，由于存在多对引物，弓丨 物之间的干扰以及引物与模板的错配而造成灵敏度下降与非特异性扩增反应增加等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物， 引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度 降又降低了检验成本。
[0005] 本发明还提供了一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测试剂盒， 不但保持了较高的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测两种致病 菌。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] -种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物，包括3对霍乱弧菌 LAMP扩增引物和3对副溶血性弧菌LAMP扩增引物，3对霍乱弧菌LAMP扩增引物具体如下： [0008]内引物ompw-FIP，序列信息见SEQ ID No. 1，
[0009] 内引物ompw-BIP，序列信息见SEQ ID Νο·2，
[0010] 外引物ompw_F3,序列信息见SEQ ID Νο.5，
[0011] 外引物〇mpw_B3,序列信息见SEQ ID Νο.6，
[0012] 环引物ompw-LF，序列信息见SEQ ID Νο·9，
[0013] 环引物ompw-LB，序列信息见SEQ ID No. 10;
[0014] 3对副溶血性弧菌LAMP扩增引物具体如下：
[0015] 内引物toxR-FIP，序列信息见SEQ ID Νο·3，
[0016] 内引物toxR-BIP，序列信息见SEQ ID Νο·4，
[0017] 外引物toxR-F3,序列信息见SEQ ID Νο·7，
[0018] 外引物toxR-B3,序列信息见SEQ ID Νο·8，
[0019] 环引物toxR-LF，序列信息见SEQ ID No.ll，
[0020] 环引物toxR-LB，序列信息见SEQ ID Νο·12。
[0021] 本发明首次开发了双重LAMP技术快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌。针 对副溶血性弧菌、霍乱弧菌分别设计3对特异性引物，引物之间的干扰小，非特异性扩增反 应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。本发明特别在 双重LAMP扩增时引入了特定的环引物，大大提高了扩增效率，缩短了检测时间。
[0022] -种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测试剂盒，包括双重LAMP扩 增反应液，所述双重LAMP扩增反应液以总体积25yL计由以下组分混合而成：
[0023] 包括双重LAMP扩增反应液，所述双重LAMP扩增反应液以总体积25yL计由以下组分 混合而成：
[0024] 反应缓冲液 12.5yL，内引物ompw-FIP lyL，内引物ompw-BIP lyL，内引物toxR-FIP lyL，内引物toxR-BIP lyL，外引物ompw-F3 0.125yL，外引物ompw-B3 0.125yL，外引物 toxR_F3 0.125yL，外引物toxR_B3 0.125yL，环引物ompw-LF 0.5yL，环引物ompw-LB 0·5μ L，环引物toxR-LF 0.5yL，环引物toxR-LB 0.5yL，Bst DNA聚合酶lyL，钙黄绿素 lyL，DNA模 板 2yL，ddH20 余量。
[0025] 本发明的检测试剂盒中包含荧光试剂，可实现荧光可视化检测，更快速直观。
[0026] 作为优选，所述反应缓冲液各组分如下：20mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，6.5mmol/L MgS04, lOmmol/L KC1，10mmol/L(NH4)2S〇4,0 · 1 %Triton X-100，1 · 6mol/L甜菜喊，1.4mmo1 / L dNTPs，ddH20余量。
[0027] 作为优选，内引物ompw-FIP、内引物ompw-BIP、内引物toxR-FIP及内引物toxR-BIP 的浓度均为20ymol/L。
[0028] 作为优选，外引物ompw_F3、外引物ompw_B3、外引物toxR_F3及外引物toxR_B3的浓 度均为20ymol/L。
[0029] 作为优选，环引物ompw-LF、环引物ompw-LB、环引物toxR-LF及环引物toxR-LB的浓 度均为20ymol/L。
[0030] 作为优选，所述Bst DNA聚合酶的浓度为8U/yL。
[0031] 作为优选，所述钙黄绿素的浓度为25ymol/L。
[0032] 一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测方法，提取样品DNA，将样 品DNA作为模板放入双重LAMP扩增反应液中进行LAMP扩增，反应时间60min，反应温度61°C， 反应结束后72°C灭活5min。在61°C，反应60min条件下引物的扩增值最高，扩增效果最好。 [0033]本发明的有益效果是：
[0034] 1、引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提 高检测速度降又降低了检验成本。
[0035] 2、与常规LAMP相比，本发明的双重LAMP不但保持了较高的特异性和敏感性，而且 更加方便、快捷和经济，一次反应可检测两个致病菌。
【附图说明】
[0036]图1是不同菌种的LAMP扩增产物特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图；
[0037] 图中：M.Marker DL2000; 1 ·黄色葡萄球菌；2 ·单增李斯特菌;3 ·哈维氏弧菌;4 ·创 伤弧菌；5.鳗弧菌;6.霍乱弧菌；7.副溶血弧菌，8.霍乱弧菌和副溶血弧菌DNA混合模板(霍 乱弧菌DNA模板lyL+副溶血性弧菌DNA模板lyL)。
[0038]图2是不同浓度DNA模板的LAMP扩增曲线图；
[0039] 图中：1.DNA稀释液 10-S2.DNA稀释液 10-2;3.DNA稀释液 10-3;4.DNA稀释液 10一4; 5. DNA 稀释液 10-5; 6. DNA 稀释液 10-6; 7. DNA 稀释液 10-7; 8. DNA 稀释液 10-8。
[0040] 图3是不同浓度DNA模板的LAMP扩增产物灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图；
[0041 ]图中：M:Marker DL 2000;1.DNA稀释液 10-S2.DNA稀释液 10-2;3.DNA稀释液 10-3; 4 · DNA 稀释液 10-4; 5 · DNA 稀释液 10-5; 6 · DNA 稀释液 10-6; 7 · DNA 稀释液 10-7; 8 · DNA 稀释液 10-8。
【具体实施方式】
[0042] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0043] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0044] 实施例：
[0045] -种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测试剂盒，包括双重LAMP扩 增反应液，所述双重LAMP扩增反应液以总体积25yL计由以下组分混合而成：
[0046] 反应缓冲液12.5yL，浓度20ymol/L的内引物ompw-FIP lyL，浓度20ymol/L的内引 物ompw-BIP lyL，浓度20ymol/L的内引物toxR-FIP lyL，浓度20ymol/L的内引物toxR-BIP lyL，浓度20μπιο 1/L的外引物ompw-F3 0 · 125yL，浓度20ymo 1/L的外引物ompw-B3 0 · 125yL， 浓度20ymol/L的外引物toxR-F3 0.125yL，浓度20ymol/L的外引物toxR-B3 0.125yL，浓度 20ymol/L的环引物ompw-LF 0 · 5yL，浓度20ymol/L的环引物ompw-LB 0 · 5yL，浓度20ymol/L 的环引物toxR-LF 0.5yL，浓度20ymol/L的环引物toxR-LB 0.5yL，浓度8U/yL的Bst DNA聚 合酶(市售）lyL，浓度为25μπιο 1/L的钙黄绿素 lyL，DNA模板2yL，ddH20余量。
[0047] 所述反应缓冲液各组分如下：20mmol/L Tris-HCl，6.5mmol/L MgS04,10mmol/L KC1，10mmol/L(NH4)2S〇4,0 · 1 % (体积分数）Triton X-100，1 · 6mol/L甜菜喊，1 · 4mmol/L dNTPs，ddH20 余量。
[0048] 1、引物设计
[0049] 通过NCBI数据库分析副溶血性弧菌的toxR(SEQ ID化.14)和霍乱弧菌的〇111?￥ (SEQ ID No. 13)种特异性基因，分别在其保守区设计引物。利用Primer premier 5.0软件 设计针对靶基因的6个区域设计特异引物并合成，引物合成委托生物公司完成。
[0050] 霍乱弧菌LAMP引物序列见表1