一种提高薄芝多糖产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物培养领域，具体涉及一种提高薄芝多糖产量的方法。
【背景技术】
[0002] 薄树芝[Ganodermacapense(L loyd)Teng]为灵芝亚属真菌薄树芝的菌丝体，又称 薄盖灵芝、薄芝，是多孔菌科灵芝属真菌。目前我国薄芝多糖主要从薄芝子实体中提取。目 前人工栽培薄芝子实体存在生产周期长，受季节、气候影响，需占用大量的土地和人力，产 量低、成本高等不利因素，因而大大限制了薄芝子实体的应用。而薄芝菌丝体液态发酵则具 有原料来源广、生产周期短、产量高、产品质量稳定等特点。因此，采用薄芝菌丝体液态发酵 生产多糖，受到人们的广泛关注，并逐渐成为国内外工业化生产应用的重要手段。
[0003] 研究表明，薄树芝的化学成分有多糖、嘌呤、嘧啶、D-甘露醇、生物碱、蛋白质、氨基 酸、脂肪酸及丰富的矿物元素等。薄树芝提取物具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、调节心血管 系统、护肝解毒、镇静、降血糖等方面的活性。作为主要活性成分的薄树芝多糖具有极其重 要的开发应用价值，当前薄树芝工业化规模生产中，大部分的研究集中在培养基和培养条 件的优化上，如碳源、氮源、无机盐、温度、pH值和转速等，但是没有从糖合成的微观角度来 提高多糖产量的方法。
[0004] 已有的研究表明，不同微生物细胞体系中多糖的合成与代谢的途径是十分相似的 (Levander&Radstrom 2001;Walling et al.2005)。利用同位素示踪技术，通过分析和测 定14C标记的葡萄糖代谢流动，结合薄芝多糖的主要单糖组成(葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘 露糖等），初步构建出薄芝胞内多糖合成的基本途经。薄芝菌体利用葡萄糖生产出薄芝多糖 需经过四个关键步骤:一是底物葡萄糖-6-磷酸的积累，这是多糖生产的前体条件;二是相 关酶类物质对代谢途径的调控，高活性a_磷酸葡萄糖变位酶可以推进代谢途径向多糖合成 方向进行;三是糖基转移酶反复的附着在运载糖基脂质体上，形成不同糖氮源；四是形成多 糖聚合体。上述反应中，a-磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 是影响多糖合成的关键酶。
【发明内容】
[0005] (一)要解决的技术问题
[0006] 针对现有技术中存在的薄芝多糖产量不够高缺陷，本发明提供一种通过调节多糖 合成酶的活性来提高薄芝多糖产量的方法。
[0007] (二)技术方案
[0008] 本发明的目的是提供一种提高薄芝多糖产量的方法，其关键步骤为在薄芝菌丝体 发酵培养基中添加 L-半胱氨酸。
[0009] 本发明所述的方法，所述薄芝菌丝体在发酵培养之前进行一级种子培养和二级种 子培养，所述一级种子培养进行旋转式培养，所述二级种子培养进行往返式培养。
[0010] 本发明所述的方法，包括如下步骤：
[0011] 1)菌种活化:取薄芝菌，接入斜面培养基，培养至白色菌丝体布满斜面；
[0012] 2)-级种子培养:在所述斜面上挑取菌丝体接入一级种子培养基中，通过旋转式 培养至菌液浅黄棕色，澄清，菌球多刺；
[0013] 3)二级种子培养:取所述一级种子培养中的菌液接种于二级种子培养基中，通过 往返式培养至菌液浅黄棕色，澄清，菌球多刺变大；
[0014] 4)发酵培养:将所述二级种子培养中的菌液接种于发酵培养基中，向所述发酵培 养基中添加 L-半胱氨酸，继续培养至薄芝的生物量不再增加，提取得薄芝多糖。
[0015] 本发明所述的方法，所述L-半胱氨酸的添加量为0.5~4%。
[0016]本发明所述的方法，所述L-半胱氨酸的添加时间为发酵培养72~96h之间。
[0017]本发明所述的方法，所述菌种活化过程中使用PDA固体培养基，28~30°C培养7~ 12天。
[0018] 本发明所述的方法，所述一级种子培养在PDA液体培养基中进行，其培养条件为： PDA培养液的体积为培养容器总体积的15%~25%，旋转式摇床的转速为180~220rpm，在 28~30°C培养3~5天。
[0019] 本发明所述的方法，所述二级种子培养在PDA液体培养基中进行，其培养条件为 PDA培养液的体积为培养容器总体积的15%~25%，接种量5%~15%，往返式摇床的转速 为80~120rpm，于28~30°C培养3~4天。
[0020] 本发明所述的方法，所述发酵培养中采用的培养基为葡萄糖2.5~3.5%，酵母膏 1.5~2.5%，硫酸镁0.08~0.12%，磷酸二氢钠0.15~0.25%，磷酸氢二钠0.15~0.25%， 大豆油0.03~0.07%，维生素 B20.01~0.02%。
[0021]本发明所述的方法，发酵培养的条件为接种量5~10%，pH4.5~6.0,温度28~30 °(3，罐压0.03~0.1]\0^，通气量2.0~5.017111丨11，转速150~200邝111，排气阀开量21.4%~ 23.4%〇
[0022]本发明所述的方法，优选包括如下步骤：
[0023] (1)取1环薄芝菌，接入PDA斜面培养基，28~30°C培养7~12天；
[0024] (2)从斜面上挑取菌丝体接入装有PDA液体培养基的培养瓶中，其中PDA液体培养 基占培养瓶体积的15%~25%，在旋转式摇床上200rpm，28~30°C培养3~5天。
[0025] (3)吸取一级种子瓶中液体接种至二级种子瓶，所述二级种子瓶中TOA液体培养基 占培养瓶体积的15~25%，接种量10%，放置往返式摇床lOOrpm，28~30°C培养3~4天。
[0026] (4)将培养好的二级种子液按照10%的接种量转种至发酵罐中培养，培养条件： 口!14.5~6.0，温度28~30°(3，罐压0.03~0.1]\0^，通气量2.0~5.017111丨11，0~7211转速 150印111，7211~19211转速200印111，排气阀开量21.4%~23.4%。接种后的72小时，向发酵罐中 加入L-半胱氨酸，添加量为2% ;继续培养至192h;所述发酵罐中的培养基为葡萄糖3%，酵 母膏2%，硫酸镁0.1 %，磷酸二氢钠0.2%，磷酸氢二钠0.2%，大豆油0.05%，维生素 B2 0.01%，L-半胱氨酸2%，pH自然。
[0027] 本发明中所述培养基中原料组成的百分数为每升培养基中包含的原料的重量，如 L-半胱氨酸的添加量为0.5~4%，在实际操作中为，每L培养基中添加5~40g的半胱氨酸。 [0028](二)有益效果
[0029]本发明所述的方法，具有如下有益效果：
[0030] 1)在宏观上，通过在发酵的特定阶段添加一定浓度的L-半胱氨酸，大大提高了薄 芝的生物量和薄芝多糖的产量。
[0031] 2)在微观上，添加一定浓度的L-半胱氨酸可促进a-磷酸葡萄变位酶活性和抑制磷 酸葡萄糖异构酶的活性，促进葡萄糖-6-磷酸向葡萄糖-1-磷酸转化，从而使得菌体代谢途 径向多糖方向进行，增加了菌体多糖含量。
[0032] 3)在一级种子培养和二级种子的培养阶段改变摇床培养模式，避免种子培养过程 中缠绕成团所致的营养力不足问题，缩短了种子培养时间，增强了种子的活力。
[0033]总之，通过该发酵方法，缩短了薄芝菌的发酵周期，节省了成本，并且提高了薄芝 菌丝体产量和多糖含量。与目前薄芝菌的工业化发酵方法相比，该方法获得的薄芝菌丝体 和多糖产量显著提高，具有广泛的应用价值和经济效益。
【附图说明】
[0034]图1薄芝菌发酵工艺流程图 [0035]图2薄芝多糖提取工艺流程图
[0036] 图3添加 L-半胱氨酸对发酵过程中a-磷酸葡萄糖变位酶活力的影响
[0037] 图4添加 L-半胱氨酸对发酵过程中磷酸葡萄糖异构酶活力的影响
【具体实施方式】
[0038]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0039] 本发明所述的方法适用于任何薄芝菌种。
[0040] 本发明所述的方法，所用培养基的具体组成为：
[0041] 斜面采用PDA固体培养基：
[0042]去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然；
[0043] 一级和二级摇瓶发酵采用PDA液体培养基：
[0044]去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，pH自然；
[0045]发酵罐培养基：
[0046] 葡萄糖3 %，酵母膏2 %，硫酸镁0.1 %，磷酸二氢钠0.2 %，磷酸氢二钠0.2 %，大豆 油0.05%，维生素 B2 0.01 %，L-半胱氨酸2%，pH自然。
[0047] 本发明所述培养方法的流程图如图1。
[0048] 实施例1
[0049] 本实例以自有保存的薄芝菌种为出发菌株进行发酵，具体包括以下步骤：
[0050] (1)取1环薄芝菌，接入PDA斜面培养基，28°C培养10天。
[00511 (2)从斜面上挑取菌丝体接入含有100mL TOA液体培养基并加有一定量灭菌玻璃 珠的500ml三角瓶中，在旋转式摇床上(200rpm)，28°