小鼠抗人Calcitonin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及以原核表达的Calcitonin蛋白免疫小鼠获得的分泌Calcitonin单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D5，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]Calcitonin即降I丐素(Calcitonin，CT)是由C细胞中位于11号染色体短臂上的相关基因编码产生的32个氨基酸组成的多肽类激素，由哺乳动物甲状旁腺滤泡的C-细胞或鱼和鸟等非哺乳类脊椎动物后鳃体分泌，分子量约为3.5kDa。
[0003]Calcitonin基因复合物由α和β基因组成。α基因有6个外显子，其中前3个与降钙素基因相关肽(CGRP)共有，外显子4为Calcitonin专用，外显子5、6为降钙素基因相关肽(CGRP)专用。β基因除3’端和5’端的非编码区与α基因不同外，其余均相同。Calcitonin的分泌主要受细胞外钙离子浓度调节，另外五肽促胃泌素、β肾上腺能激动剂、生长素释放激素和胃肠肽等都会促进Calcitonin的分泌。
[0004]甲状腺髓样癌(medullar carcinoma of thyroid, MCT)是起源于甲状旁腺滤泡细胞(C细胞或称降钙素分泌细胞)的一种非常少见的内分泌系统恶性肿瘤，易于复发和转移。由于甲状腺髓样癌恶性程度高且预后较差，因此早期发现、早期诊断、早期治疗有着十分重要的临床意义，而术前、术后对肿瘤标志物的检测尤为突出。许多研究显示，降钙素(Calcitonin)是特异的甲状腺髓样癌标志物，通过免疫组织化学检测可以看出降钙素(Calcitonin)水平能够直接反映出肿瘤组织中降I丐素(Calcitonin)的合成情况，进而反映出肿瘤的生长情况。降钙素(Calcitonin)可以作为一个预测甲状腺髓样癌颈淋巴结转移以及判断治疗效果的重要指标，对于甲状腺髓样癌的早期诊断、判断手术效果及预后观察，具有重要意义。Calcitonin抗体可以应用于甲状腺C细胞增生、甲状腺髓样癌及部分神经内分泌肿瘤的研究。
[0005]目前，国内外已经获得了多种Calcitonin的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的Calcitonin的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测Calcitonin表达的小鼠抗人Calcitonin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[0007 ]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
(O根据Calcitonin的基因序列(匪_001033952.2)的编码框，设计I对特异引物，Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增Calcitonin基因，构建重组表达载体PET28a_Calcitonin，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。
[0008](2)采用经典的细胞融合技术制备Calcitonin单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。
[0009](3)采用免疫印迹法通过免疫组织化学分析Calcitonin单克隆抗体染色人甲状旁腺石蜡切片。
[0010](4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体Calcitonin重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体Calcitonin的重链和轻链可变区序列。
[0011]本发明提供的以原核表达的Calcitonin蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌Calcitonin单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为7D5，分类命名为小鼠抗人Calcitonin杂交瘤细胞系，该细胞株7D5已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.6919。
[0012]本发明还提供了所述杂交瘤细胞株7D5，CGMCCN0.6919产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 10。
[0013]本发明的优点和有益效果
本发明应用重组人的Calcitonin蛋白为免疫抗原，免疫BalbA^Ht，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗Calcitonin抗体的杂交瘤细胞株，命名为7D5，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对Calcitonin单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在I: 100000以上。人甲状旁腺石錯切片经抗Calcitonin抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆中出现均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的Calcitonin单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的Calcitonin蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测Calcitonin表达。
【附图说明】
[0014]图1 SDS-PAGE分析纯化后的Calcitonin单克隆抗体。
[0015]图2 ELISA法测定Calcitonin单克隆抗体滴度。
[0016]图3是免疫组织化学检测分析Calcitonin单克隆抗体染色人甲状旁腺石蜡切片。
【具体实施方式】
[0017]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。
[0018]实施例1:杂交瘤细胞株7D5及其产生的单克隆抗体的获得
1、抗原制备
(I)获得目的基因
在该实施例中，根据Calcitonin的基因序列(NM_001033952.2)的编码框，设计I对特异引物:
引物1:5’_ TCAGGATCCATGGGCTTCCAAAAGTTCT -3’ (SEQ ID NO:1)引物2:5’_ TTACTCGAGTTAGTTGGCATTCTGGG -3’；(SEQ ID NO: 2)
Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增Calcitonin基因。
[0019](2)构建重组表达载体
将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒 PET28a-Calcitonin。
[0020](3)获得含重组表达质粒的表达菌种
将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
[0021](4)诱导表达和蛋白纯化
将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至1ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37°C，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mM IPTG诱导表达，16°C诱导过夜，收集菌液超声，取上清用N1-NTA琼脂糖亲和层析法纯化Calcitonin蛋白。
[0022]2、单抗的制备和纯化 (I)、免疫动物
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。
[0023]首次免疫。纯化的重组蛋白Calcitonin(用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，10yg/只，颈背部皮下多点注射；
二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白Calcitonin(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，I OOyg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白Calcitonin(用适量生理盐水稀释)，不完全弗氏佐剂，I OOyg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫后7?10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。
[0024]加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。
[0025]⑵、细胞融合
采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1:5-1:10)，并加入促