一种提高肝细胞增殖活性的细胞培养方法
【专利说明】
(一)
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种提高肝细胞增殖活性的细胞培养方法。
(二)
【背景技术】
[0002]肝病是人体常见的疾病，尤其是肝功能衰竭严重危害人类的健康，肝移植是治疗由肝炎、肝硬化等引起肝脏功能衰竭的有效方法，但供体肝脏的紧缺无法满足临床的需要。肝脏组织工程学就是在此背景下逐步形成的一种以构建可移植的肝脏为目的的学科，它将为肝脏再生带来希望。肝脏组织工程学的核心是建立一种具有生命活力的细胞与生物材料三维复合体，对病损的肝脏组织进行形态、结构与功能的重建，实现肝脏的永久化替代。
[0003]肝细胞的三维体外培养，是肝组织工程的主要方法，通常以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、海藻酸钠、壳聚糖等作为支架材料进行肝细胞球体的三维培养，该方法虽可以维持肝细胞体外较长的功能与活性，但与体内肝脏的真实结构差异较大。结合肝脏组织的细胞组成，并细胞共培养技术，将非肝细胞与肝细胞共培养，能更好的模拟肝细胞在体内的微环境，有助于提高肝细胞的功能与活性。
[0004]血管新生是肝组织工程研究的主要难点。脂肪干细胞是间充质干细胞(MSCs)的一种，具有取材容易、来源充足、体内储备量大、无免疫排斥反应等优点。研究表明，脂肪干细胞与内皮细胞共培养后，会分化成周细胞，可促进内皮细胞的血管新生，且该应用在动物体内、外均得到证实，说明脂肪干细胞在一定程度上可促建血管新生(Ma J，Yang F，Both SK，et al.1n vitro and in vivo ang1genic capacity of BM-MSCs/HUVECs and AT-MSCs/HUVECs cocultures.B1fabricat1n.2014，6(1):015005;Takebe T,Enomura M，Yoshizawa E,et al.Vascularized and Complex Organ Buds from Diverse Tissuesvia Mesenchymal Cell-Driven Condensat1n.Cell Stem Cell.2015，16(5):556-65.)。另一方面，脂肪干细胞也是较为理想的种子细胞，由于其具有很强的自我更新能力和多向分化潜能(如向肝细胞分化)，可以用于治疗各种终末期肝病如脂肪肝、肝硬化等(Zhang Y,Chen XM,Sun DL.Effects of coencapsulat1n of hepatocytes with adipose-derivedstem cells in the treatment of rats with acute-on-chronic liver failure.1nt JArtif Organs.2014，37:133-141;Saito Y,Shimada M,Utsunomiya T,et al: Theprotective effect of adipose-derived stem cells against liver injury bytrophic molecules.J Surg Res.2013,180:162-168；Harn HJ,Lin SZ,Hung SH,et al:Adipose-derived stem cells can abrogate chemical-1nduced liver fibrosis andfacilitate recovery of liver funct1n.Cell Transplant.2012，21:2753-2764.)。因此，将由脂肪干细胞、内皮细胞与肝细胞共培养，有助于进一步解决肝组织工程血管化的难题。
[0005]综上所述，开发一种能增强肝细胞功能与活性的细胞培养方法，具有极大的应用前景。(三)
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种可增强肝细胞增殖活性的细胞培养方法。
[0007]本发明采用的技术方案是:
[0008]—种提高肝细胞增殖活性的细胞培养方法，所述方法包括:将肝细胞与血管内皮细胞、脂肪干细胞细胞按照14:2?4:2?4的比例(数量比)，于共培养培养基中共培养3天以上，培养获得的细胞可进一步用于治疗或预防；所述共培养培养基组成如下:10%胎牛血清，100IU/mL青霉素，100yg/mL链霉素，50μΜ地塞米松，10ng/mL人源肝细胞生长因子，20ng/mL人源内皮生长因子，溶剂为1640培养基。细胞培养条件为常规细胞培养条件，37°C、5 %C02，隔天换液。青霉素和链霉素一般是购买双抗混合溶液，其中含有青霉素10000IU/mL和链霉素10000yg/mL，使用时按1 %体积用量加入培养基中。
[0009]优选的，所述肝细胞为L02细胞株(人肝永生化细胞株)，所述血管内皮细胞为HUVECs细胞株(人脐静脉血管内皮细胞株)，所述脂肪干细胞细胞为人脂肪干细胞，三者比例为 14:3:3。
[0010]具体的，所述方法如下:
[0011 ] (1)肝细胞L02细胞株采用完全培养基培养长至80 %?90 %融合度时，去完全培养基，0.01M PBS洗涤，0.25 %胰酶消化2分钟后，加入等体积完全培养基终止，离心、收集细胞，加入共培养培养基，调整细胞溶度为2.8 X 106个/mL，得到肝细胞细胞液；
[0012](2)血管内皮细胞HUVECs细胞株采用完全培养基培养长至80 %?90 %融合度时，去完全培养基，0.01M PBS洗涤，0.25 %胰酶消化2分钟后，加入等体积完全培养基终止，离心、收集细胞，加入共培养培养基，调整细胞溶度为0.6 X 106个/mL，得到血管内皮细胞细胞液；
[0013](3)人脂肪干细胞采用完全培养基培养长至80 %?90%融合度时，去完全培养基，
0.01M PBS洗涤，0.25%胰酶消化2分钟后，加入等体积完全培养基终止，离心、收集细胞，加入共培养培养基，调整细胞溶度为0.6 X 106个/mL，得到人脂肪干细胞细胞液；步骤(1)?
(3)中，所述完全培养基组成如下:10%胎牛血清，100IU/mL青霉素，100yg/mL链霉素，溶剂为1640培养基;所述共培养培养基组成如下:10%胎牛血清，100IU/mL青霉素，100yg/mL链霉素，50μΜ地塞米松，10ng/mL人源肝细胞生长因子，20ng/mL人源内皮生长因子，溶剂为1640培养基；
[0014](4)将前述肝细胞、血管内皮细胞、脂肪干细胞细胞液等体积混合后，接种于6孔板中的共培养培养基中，37°C、5 % C02共培养3?7天，隔天换液。
[0015]优选的，所述步骤(4)每孔接种细胞总数为0.4X106个，S卩L02细胞、HUVECs细胞、脂肪干细胞的细胞密度分别为2.8 X 105个/孔，0.6 X 105个/孔，0.6 X 105个/孔。
[0016]为了更好的模拟体内微环境，本发明选择在体内非肝细胞中占较大比例的血管内皮细胞与肝细胞共培养，更有利于肝细胞的生长。
[0017]为了提高血管内皮细胞的血管新生功能，本发明选择可促进血管内皮细胞血管新生的脂肪干细胞与血管内皮细胞、肝细胞共培养，为血管化肝组织工程提供可能。
[0018]本发明的有益效果主要体现在:采用本发明细胞培养方法，能更好的模拟肝细胞在体内真实结构与功能，培养出的肝细胞活性能更好的维持肝细胞在体外的功能与活性。(四)
【附图说明】
[0019]图1为肝细胞与血管内皮细胞、脂肪干细胞共培养后细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)的活性。
[0020]图2为肝细胞与血管内皮细胞、脂肪干细胞共培养后细胞上清尿素(Urea)的含量。[0021 ]图3为肝细胞与血管内皮细胞、脂肪干细胞共培养后细胞上清白蛋白(ALB)的含量。
[0022]图4为肝细胞与血管内皮细胞、脂肪干细胞共培养后，肝细胞白蛋白(ALB)的表达情况。A图为肝细胞ALB表达的免疫荧光图片;B为肝细胞ALB表达的图片定量结果。
[0023]图5为肝细胞与血管内皮细胞、脂肪干细胞共培养后，肝细胞细胞色素氧化酶(CYP450)亚家族3A4(CYP3A4)的表达情况。A图为肝细胞CYP3A4表达的免疫荧光图片;B为肝细胞CYP3A4表达的图片定量结果。
[0024]图6为肝细胞与血管内皮细胞、脂肪干细胞共培养后，肝细胞肝细胞核因子4-alpha (HNF-4a)的表达情况。A图为肝细胞HNF-4a表达的免疫荧光图片;B为肝细胞HNF-4a表达的图片定量结果。
(五)
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发