能快速降解17β-雌二醇的复合菌及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种能快速降解17β-雌二醇的复合菌，应用该复合菌剂快速降解畜禽养殖废弃物中的类固醇雌激素一 17β-雌二醇，以减少环境污染并实现畜禽粪便的资源化利用。
【背景技术】
[0002]现代化养殖大量使用的促生长类药物，加之动物自身分泌的激素，使得畜禽粪便中类固醇雌激素含量非常高，如平均每头奶牛通过粪便排除的17β—雌二醇当量达到了 165微克/天，通过尿液形式排除的则高达498微克/天，使得畜禽养殖源的类固醇雌激素排放量远远超过了污水处理厂排水，成为环境中类固醇雌激素的主要污染源。类固醇雌激素的中毒机制主要包括模拟、干扰或对抗机体内生荷尔蒙原有的正常合成、运输和释放，使其无法维持自身的平衡和调节，引起动物界的雌性化现象。类固醇雌激素在水环境中以很低的浓度即可产生严重危害，17β —雌二醇在河水中的含量仅为lng/L时就会造成雄鱼的雌性化。欧盟规定的12种内分泌干扰物中就包括类固醇雌激速和雌酮，并且17β—雌二醇被明确认为是致癌物质。由于疏水性强和生物可利用行低，特定条件下类固醇雌激素在环境中的滞留期会延长，污染范围会扩大，环境风险也因此而增加。因此有必要针对畜禽养殖源排放的类固醇雌激素污染物进行有效的源头治理，在畜禽粪便资源化利用前降解去除类固醇雌激素污染物。
[0003]畜禽养殖源的类固醇雌激素的治理方法主要包括化学法和生物法。化学法主要是利用光催化，其缺点是处理成本高，主要适用于养殖废水中雌激素的去除，对固态的养殖废弃物中类固醇雌激素的去除能力非常有限;臭氧可氧化类固醇雌激素而使其降解，但成本非常高，不适宜于小型养殖场，并且如果氧化程度不彻底可产生仍然有雌激素活性的中间代谢产物，因此不宜大规模推广。生物法主要是利用微生物的新陈代谢作用来降解环境中的类固醇雌激素，由于生物法具有成本低，无二次污染，适用面广等特点，在畜禽养殖排放源类固醇雌激素的生物治理方面具有明显的优势，越来越引起人们的重视。
[0004]国内外主要是从留体雌激素生产企业的废水和活性污泥中分离获得高效的类固醇激素降解菌，从污水处理的角度进行的研究。而畜禽养殖是水环境及污水中类固醇激素的主要来源，因此对畜禽养殖过程进行类固醇激素污染的源头控制，可有效去除水体中的类固醇激素，对传统的污水处理系统不需要提出更高的要求，否则末端治理时需要对传统的污水处理技术和单元进行改善和升级才能达到对类固醇激素的有效去除。目前国内外主要是从单一菌株的角度出发，研究其降解机理以及对污水中类固醇激素的去除，并没有完整地开展畜禽养殖过程中类固醇激素的降解研究和应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是解决自然环境下17β_雌二醇降解速率低和单一降解菌环境适应能力低的问题，提供一种能快速降解17β_雌二醇的复合菌。具体而言，本发明是从环境中分离出高适应能力和强降解效果的土著复合菌株，即利用复合菌株之间的协同共生作用和数量结构的自我调节作用来扩大其应用范围，增强其降解类固醇雌激素的能力。该复合菌可快速降解处理畜禽养殖废弃物和土壤中的17β-雌二醇，有效降低畜禽养殖中由17β-雌二醇污染带来的生态和人体健康风险。
[0006]本发明能快速降解17β_雌二醇的复合菌，是由保藏号为CGMCCN0.10814的乙酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus LM1和保藏号为CGMCC N0.10815的假单胞菌Pseudomonas sp.LYl组成。
[0007]通过大量试验证实，所述的乙酸钙不动杆菌LM1和假单胞菌LY1以1:1的细胞数量比混合，对处理畜禽养殖废弃物和土壤中的17β-雌二醇，降解效率最佳。
[0008]本发明能快速降解17β_雌二醇的复合菌由以下方式获得:
[0009]1、菌种驯化培养与筛选
[00?0]分别从养猪场、养鸡场、养牛场米集堆放的畜禽奠便和废物处理设施中米集样品，按照质量比1:1的比例混合，取混合样品50g加入到500ml无菌水中，150rpm下振荡提取菌体细胞，将提取液按5 %的比例接入到以20mg/Ll7β—雌二醇(17β —雌二醇)为唯一碳源的无机盐培养基中驯化培养5天，取培养物再接种至含有17β—雌二醇的新鲜无机盐培养基中驯化培养，待培养液变浑浊后再接种驯化培养，将最后一次的培养物梯度稀释后涂布于固体的牛肉膏蛋白胨培养基上培养，挑取单个菌落，划线纯化后分别将单一和复合菌以及睾丸酮丛毛单胞菌ATCC11996的菌悬液加入到17β—雌二醇为唯一碳源的无机盐培养基中培养，根据17β—雌二醇的降解率最终筛选出可高效协同降解17β—雌二醇的两株菌，分别命名为LY1 和 LM10
[0011]2、菌种的鉴定与保藏
[0012]用形态观察、革兰氏染色和16SrRNA基因序列分析方法，对能够快速协同降解17β—雌二醇的2种菌株进行鉴定，并于2015年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其中乙酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus LM1 的保藏号CGMCC N0.10814，假单胞菌Pseudomonassp.LYl的保藏号为CGMCC N0.10815。
[0013]所述菌株LM1，通过菌落特征色、革兰氏染和生理生化检测试验，表明具有以下特征及生物特性:在LB琼脂上经30°C培养24小时，呈乳白色不透明的圆形菌落，直径1.5mm左右，中央隆起，表面及边缘均光滑，粘而附于培养基上。革兰氏染色镜检为阴性菌，细胞成杆状，可形成不同长度的链状，静止期成球形，常成对。无芽孢。生化特性结果显示，分离菌株LM1能利用D-葡萄糖、D-甘露糖、D-纤维二糖、其它糖醇类不能利用；不利用苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸以及精氨酸;能在柠檬酸盐(钠)、丙二酸盐中生长。氧化酶阴性，触酶阳性，不产硫化氢，可利用琥珀酸盐产碱，对卡那霉素无抗性，葡萄糖产酸。
[0014]所述菌株LY1菌株，通过菌落特征色、革兰氏染和生理生化检测试验，表明具有以下特征及生物特性:在LB琼脂上经30°C培养24小时，菌落中间微凸出，透明，表面湿润光滑。革兰氏阴性，短杆状，0.5?Ι.ΟμπιΧ 1.5?5.Ομπι，不产芽孢，好氧。生化特性结果显示，利用D-葡萄糖，不能利用D-纤维二糖，可利用柠檬酸盐(钠)丙二酸盐和柠檬酸盐，乳酸盐产碱，琥珀酸盐产碱，对卡那霉素无抗性。
[0015]16S rRNA基因序列分析和同源性比较表明菌株LM1与乙酸钙不动杆菌的同源性最高，菌株LY1与假单胞属的菌株同源性最高。综合上述结果，菌株LM1和LY1分别被鉴定为乙酸钙不动杆菌和假单胞菌。
[0016]3、复合菌的制备
[0017]首先将菌株LY1和LM1的菌体细胞分别划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基上在25°C下培养24h，然后向长满菌体细胞的平板中加入无菌水，用玻璃棒使菌体细胞脱离培养基进入无菌水中，将含菌体细胞的悬浊液漩涡振荡均匀后，再利用无菌水将菌悬液的OD600调节为0.10-0.20(细胞数量为106-107CFU/ml)，将两株菌的菌悬液以1:1的细胞数量比混合，即得复合菌。
[0018]复合菌剂降解17β_雌二醇的环境因子响应特征测试:
[0019](1)碳氮比对复合菌降解17β—雌二醇的影响
[0020]分别取0.5mL 17β—雌二醇储备液加入到12个盛有100mL无氮无机盐培养基(去掉原无机盐培养基中的硫酸铵)的250mL三角瓶中，向4个三角瓶中分别加入不同