塔宾曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品生物技术领域，涉及低聚果糖的生产方法，具体涉及一株塔宾曲霉培养及其全细胞催化生产低聚果糖的方法。
【背景技术】
[0002]低聚果糖，又称鹿果低聚糖(Fructooligosaccharides，缩写为F0S)，是由1?3个果糖基通过β?1，2糖苷键与蔗糖结合而生成蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的混合物。F0S具有促进肠道内益生菌，例如双歧杆菌的增殖，排毒清洁肠道，提高人体免疫力，改善脂质代谢，预防蛀牙，不被消化道吸收利用等优异性能，现被作为功能性食品配料广泛用于保健食品中。
[0003]目前以蔗糖为原料生产低聚果糖有两种方法:(1)液体深层发酵法；(2)固定化酶法。这两种方法都是以鹿糖为原料，由呋喃果糖苷转移酶(β-Fructofuranosidase)进行果糖基转移反应而合成，蔗糖既是果糖的供应者也是接受者。得到广泛应用的是深层液体发酵法，是指利用能分泌呋喃果糖基转移酶的微生物，经过培养后从培养液分离收集菌丝体，将菌丝体投入到含蔗糖、蛋白质、无机盐的复杂转化溶液中，在一定的条件下转化为含有低聚果糖(F0S)的糖浆。液体深层发酵法需要前期投入大量的发酵设备及其附属设备，所生产出来的产品成分发杂，不仅要除去大量的菌丝体，蛋白质和无机盐等杂质，而且还容易发生美拉德褐变，给后期的分离纯化带来诸多的困难，并且易使产品色度加深，影响感官质量。
[0004]而固定化酶的方法，因为固定后的酶容易游离，且底物与产物不断穿过载体屏障，产率会受到很大影响，专利号:01128345.9的中国发明专利主要利用固定化果糖基转移酶生产低聚果糖，先培养出大量菌丝体，将菌丝体破壁后将酶分离纯化，再将酶与有机高聚物进行交联固定化后，用分批或柱式反应法进行固定化果糖基转移酶生产低聚果糖。该方法的不足之处是步骤繁多，酶在固定化过程中非常容易失活，转化率低，由于蔗糖和转化后的产物要穿过固定化的颗粒，传质均匀性受到限制。另外，酶的分离纯化过程复杂且在此过程中酶活性有部分损失，在立体结构环境中不稳定，易失活等缺点，且酶的价格昂贵，造成固定化酶法转化成本较高，这些方面均严重制约了其在工业化上的应用。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有低聚果糖生产技术的不足，目的在于提供一株塔宾曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案。
[0007]—株塔宾曲霉是指塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)Xgl7L21，已于2015年11月16日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.11650。地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101o
[0008]—株塔宾曲霉进行全细胞催化生产低聚果糖的方法，包括以下步骤:
(1)利用塔宾曲霉Xgl71?21菌种制备塔宾曲霉全细胞；
(2)利用上述塔宾曲霉全细胞催化蔗糖生产低聚果糖。
[0009]优选地，步骤(1)所述塔宾曲霉全细胞的制备，包括如下步骤:
(1-1)将保存在PDA斜面上的塔宾曲霉菌种进行活化;活化培养基为PDA斜面培养基；(1-2)将活化后的孢子接种到发酵培养基中，培养一定时间后的菌体溶液为塔宾曲霉全细胞溶液；
(1-3)收集塔宾曲霉全细胞溶液，用滤布滤抽、洗涤、再抽滤，得到具有转化活性的塔宾曲霉全细胞。
[0010]优选地，步骤(2)所述塔宾曲霉全细胞催化生产低聚果糖的步骤如下:
(2-1)将所得的塔宾曲霉全细胞置于F0S转化体系中进行转化，F0S转化体系是蔗糖溶液；
(2-2 )转化完成后，过滤转化液，回收塔宾曲霉全细胞菌体，过滤液经过浓缩，即制得低聚果糖。
[0011]进一步优选地，步骤(1)所述塔宾曲霉全细胞的制备，包括如下步骤:
(1-1)将保存在PDA斜面上的塔宾曲霉菌种进行活化。活化培养基为PDA斜面培养基，培养温度28?32°C，培养时间36?60h。
[0012](1-2)将活化后的孢子接种到发酵培养基中，接种量1 X 105个/L?1 X 101Q个/L，于28?32°C，转速为100r/min?300r/min的条件下培养48?72h后的菌体溶液制成塔宾曲霉全细胞溶液；
(1-3)收集步骤(2)所得的塔宾曲霉全细胞溶液，用200目?400目的滤布抽滤、洗涤、再抽滤，得到具有转化活性的塔宾曲霉全细胞。
[0013]优选地，所述的发酵培养基包括以下质量浓度的原料:100?200g/L蔗糖，5?20g/L酵母膏，1 ?10g/LNaN03,0.1 ?lg/L的MgS(k，1 ?10g/L的Na2HP04，0.01 ?0.lg/L的FeS〇4和
0.01?0.1g/lJ9CuS04。
[0014]进一步优选地，步骤(2)所述塔宾曲霉全细胞催化生产低聚果糖的步骤如下:
(2-1)按4?8U(酶活)/g蔗糖(干基)，将所得的塔宾曲霉全细胞置于F0S转化体系中，
F0S转化体系是重量百分比为40?60%的蔗糖溶液。于温度45?55°C，转速为100r/min?200r/min的条件下进行转化4?12h ；
(2-2)转化完成后，过滤转化液，回收塔宾曲霉全细胞菌体，过滤液经过旋转蒸发仪浓缩，即制得低聚果糖。
[0015]所述塔宾曲霉具有如下性质:
(1)形态特征:该菌株为需氧菌，菌丝为乳白色，孢子为黑色。
[0016](2)生理特征:最适生长温度25?35°C，最适合生长pH为5.5?6.0，具有可将蔗糖转化为低聚果糖的酶活，转化率高，催化生成F0S的含量为55%以上。
[0017]本发明所述菌株Xgl71?21，根据对其形态特征观察和18S rDNA—ITS序列分析，确定该菌株为塔宾曲霉。该种全细胞酶制剂制备方法简单，不涉及到酶的分离纯化，低聚果糖的生产工艺单大大简化，而且操作方便，酶活性高，转化时间短，这种全细胞酶制剂具有转化效率高，性能稳定的特点。本发明得到的低聚果糖经高效液相色谱检测，低聚果糖的含量(占总固形物)> 55%，具有重要的工业价值。
[0018]本发明与现有的技术相比，具有如下的优点:
(1)本发明方法简单，不涉及到酶的纯化，简化了设备和投资。
[0019](2)塔宾曲霉所需要的营养低，易培养，易操作，培养方法简单，细胞体相当于酶的天然保护层，可有效避免酶的失活，免去了酶的固定化步骤。
[0020](3)简化了低聚果糖的生产工艺，直接将塔宾曲霉全细胞投入到蔗糖溶液中，减少了液体深层发酵培养中发酵罐及其附属设备的投入。
[0021](4)将塔宾曲霉全细胞投入到F0S的转化体系中，所得的F0S糖液不需要经过脱色，离子交换柱脱盐，只需要经过简单的过滤，浓缩后即可得到固形物中的总低聚果糖含量255%的F0S糖浆，符合GB/T23528-2009低聚果糖中的非强制性国家标准，整个工艺简单，操作方便，生产成本明显降低。
[0022]【附图说明】:
图1为本发明实施例1利用塔宾曲霉全细胞催化蔗糖得到的F0S糖浆的HPLC图。
[0023]图2为本发明塔宾曲霉全细胞催化生产F0S糖浆的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0024]塔宾曲霉Xgl71?21的18S rDNA序列为 GGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTT
AATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATCTTTTGGATGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGCGTTTGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGGGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTGCGCGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGGGCCAGCGAGTACATCACCTTGGCCGAGAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACCCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCACGAGTCATCAGCTCGTGCCGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCGGTGAGGCCTTCGGACTGGCCCAGGAGGGTTGGCAACGACCCCCCAGGGCCGGAAAGTTGGTCAAACCCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGA塔宾曲霉Xgl71?21的ITS序列为
ATTACCGAGTGCTGGGTCCTTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGCCTGCCCCCGGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTCGATTGATACCAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGGCCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAGAGAAACGGCGGCACCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGCCCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATTGACCTCGGATCAGGTAGGACTACCCGCTG实施例1
(1)将保存在PDA斜面上的塔宾曲霉菌种进行活化，活化培养基为PDA斜面培养基，培养温度30°C，培养时间48h。
[0025](2)将活化后的孢子接种到发酵培养基中，接种量1 X106个/L，于30°C，转速为160r/min的条件下培养72h后的菌体溶液制成塔宾曲霉全细胞溶液;发酵培养基质量浓度为 150g/L蔗糖，lOg/1 酵母膏，10g/LNaN03，0.5g/L的MgS(k，4g/L的Na2HP04，0.0lg/L的FeS(k和Ο.0lg/L的CuS04。搅拌溶解均匀后灭菌，冷却后备用。
[0026](3)收集第二步所得的塔宾曲霉全细胞液体溶液，用无菌的400目的滤布抽滤，用蒸馏水洗涤，再抽滤，得到具有转化活性的塔宾曲霉全细胞。
[0027](4)按6U(酶活)/g蔗糖(干基)，将所得的塔宾曲霉全细胞置于FOS转化体系中，FOS转化体系是重量百分比为50%的蔗糖溶液。于温度50°C，转速为lOOr/min的条件下进行转化6h；
(5)转化完成后，过滤转化液，回收塔宾曲霉全细胞菌体，过滤液经过旋转蒸发仪浓缩，即制得低聚果糖。
[0028]根据国标GB/T23528-2009中低聚果糖的