发酵法高密度培养小球藻生产工艺的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及小球藻的大规模培养技术领域，具体涉及发酵法高密度培养小球藻生产工艺。
【背景技术】
[0002]小球藻为绿藻门小球藻属的普生性单细胞藻类，是一种简单的光合作用有机体，最常见的蛋白核小球藻以含有丰富的蛋白质而被应用于商业开发，同时还富含多种维生素、多糖、不饱和脂肪酸、氨基酸、膳食纤维、微量元素及其它活性物质，具有抗肿瘤、抗辐射、抗感染、抗动脉粥样硬化、降血压、降血脂、防治贫血等一系列生理保健作用，是目前保健食品应用中能进行商业化生产的微藻之一。
[0003]目前，小球藻的大规模培养主要采用户外开放池，存在藻细胞密度低、品质低、易污染等问题。
【发明内容】
[0004]针对上述小球藻大规模培养中存在的问题，本发明提出了一种发酵法高密度培养小球藻生产工艺，该工艺采用发酵罐内流加营养物质的方式对小球藻进行异养培养，不仅可以实现纯种培养，还能较高程度的提高藻类品质，蛋白质及干重含量较高，同时还含有其他多种维生素，符合人体营养需求。
[0005]其技术解决方案包括:
[0006]—种培养小球藻的生产工艺，依次包括以下步骤:
[0007]a选取优质小球藻藻种并将其活化，接种培养，使小球藻种子液的浓度在8?I Ig/L；
[0008]b异样培养，包括四个阶段:
[0009]匕第一阶段:将步骤a培养至生长对数期的小球藻种子液，接入150L的种子罐中进行异样培养，其中，150L的种子罐中培养基组成如下:
[0010]葡萄糖:30-60g/L，硫酸镁:0.5-1.6g/L，柠檬酸钙:0.1-0.5g/L，磷酸钠:1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾:0.3-0.8g/L，硫酸亚铁:0.05-0.lg/L,乙二胺四乙酸二钠:0.3-0.6g/L，尿素:3-8g/L，微量元素和水；
[0011]培养控制条件:
[0012]温度:30-35。。，罐压:0.03-0.08MPa，风量:1.0-2.0vvm,D0>20% ,pH:5.5-7.5；
[0013]匕第二阶段:待第一阶段小球藻种子液培养24?32h、碳源耗尽溶氧反弹且小球藻种子液干重在20?25g/L、pH在6?7培养正常时，将其接种至1.5方罐中异样培养;反之，重新进入第一阶段培养；
[0014]该阶段的培养基组成与第一阶段种子罐中的培养基成分相同，并且，培养控制条件也与第一阶段培养控制条件相同；
[0015]b3第三阶段:待二阶段小球藻种子液培养24?32h、碳源耗尽溶氧反弹且小球藻种子液干重在20?25g/L、pH在6?7培养正常时，将其接种至17方罐中异样培养;反之，重新进入第二阶段培养；
[0016]该阶段的培养基组成与第一阶段种子罐中的培养基成分相同，并且，培养控制条件也与第一阶段培养控制条件相同；
[0017]b4第四阶段:待待三阶段小球藻种子液培养24?32h、碳源耗尽溶氧反弹且小球藻种子液干重在20?25g/L、pH在6?7培养正常时，将其接种至50方罐中异样培养;反之，重新进入第三阶段培养；
[0018]所述50方罐中的培养基分为基础培养基和流加培养基，所述流加培养基分为四次加入；
[0019]基础培养基的组成如下:
[0020]葡萄糖:50-60g/L，硫酸镁:0.8-1.6g/L，柠檬酸钙:0.2-0.5g/L，磷酸钠:1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾:0.4-0.8g/L，硫酸亚铁:0.08-0.lg/L,乙二胺四乙酸二钠:0.3-0.6g/L，尿素:3-8g/L，微量元素和水；
[0021]流加培养基的组成如下:
[0022]葡萄糖:200g/L，硫酸镁:4g/L，柠檬酸钙:1.5g/L，磷酸钠:5g/L，磷酸氢二钾:2g/L，硫酸亚铁:0.4g/L，乙二胺四乙酸二钠:2g/L，尿素:15g/L，微量元素和水；
[0023]c诱导培养，
[0024]待第四阶段培养至碳源耗尽、溶氧反弹时，进行诱导培养，诱导温度为30?35°C，罐压:0.04?0.06MPa，风量:1.5?2.0vvm，尿素含量> 4g/L。
[0025]上述技术方案中，在异样培养阶段，依次从第一阶段到第四阶段，前三阶段的培养利于藻种的稳定生长，在第四阶段，通过基础培养基和流加培养基的配合，利于对蛋白核小球藻进行高密度异养培养，分次添加流加培养基，利于小球藻的生长。
[0026]作为本发明的一个优选方案，步骤In中，微量元素配方为:硫酸锰:4.0_8mg/L，硫酸锌:0.5-0.8mg/L，钼酸:0.1-0.5mg/L，硫酸铜:0.1-0.8mg/L，硼酸:10_15mg/L。
[0027]作为本发明的另一个优选方案，流加培养基的具体加入方式为:当发酵培养20?25h，且碳源耗尽、溶氧反弹、pH在6?7.5时，第一次加入流加培养基；当发酵培养32?38h，且碳源耗尽、溶氧反弹，pH在6?7.5时，第二次加入流加培养基；当发酵培养43?47h，且碳源耗尽、溶氧反弹，pH在6?7.5时，第三次加入流加培养基；当发酵培养53?57h，且碳源耗尽、溶氧反弹，pH在6?7.5时，第四次加入流加培养基。
[0028]优选的，步骤b4中流加培养基中微量元素的配方为:
[0029]硫酸猛:25mg/L，硫酸锌:2.5mg/L，钼酸:1.5mg/L，硫酸铜:2.5mg/L，硼酸:50mg/L。
[0030]本发明所带来的有益技术效果:
[0031 ]本发明发酵法高密度培养小球藻生产工艺，既能保持小球藻高密度状态，又能获得高含量的蛋白和叶绿素，为工业化生产蛋白核小球藻提供了高效的培养方法。
[0032]本发明通过流加碳源、氮源、无机盐、微量元素，能快速积累蛋白核小球藻藻体浓度，缩短异样培养周期，大幅降低生产成本。
[0033]本发明发酵法高密度培养小球藻，诱导工艺能大幅提高蛋白核小球藻蛋白含量，叶绿素含量。
【附图说明】
[0034]下面结合附图对本发明做进一步说明:
[0035]图1为本发明实施例1菌体干重和蛋白含量随时间变化图；
[0036]图2为本发明实施例2菌体干重和蛋白含量随时间变化图；
[0037]图3为本发明实施例3菌体干重和蛋白含量随时间变化图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
[0039]本发明所培养的小球藻，为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径3?8微米。
[0040]在上述生产工艺中的藻种是通过商业渠道购买获得的优质藻种，在配置培养基中所需的原料也可通过商业渠道购买获得。
[0041 ] 实施例1:
[0042]本发明，小球藻的生产工艺，具体采用下述方法:
[0043](I)将活化小球藻藻种，新接的摇瓶放入摇床中光照培养，正常培养3天后按照传代操作接入5L摇瓶培养3天为2代，继续传代，传至第3代时，在摇床中光照培养，正常培养3天后测藻液浓度达到10g/L;
[0044](2)将步骤(I)培养生长对数期的小球藻种子液，按10% (v/v)接入150L种子罐中进行异样培养；
[0045]150L种子罐定容100L，
[0046]培养基配方为:
[0047]葡萄糖:30-60g/L，硫酸镁:0.5-1.6g/L，柠檬酸钙:0.1-0.5g/L，磷酸钠:1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾:0.3-0.8g/L，硫酸亚铁:0.05-0.lg/L,乙二胺四乙酸二钠:0.3-0.6g/L，尿素:3-8g/L，微量元素，水；
[0048]其中微量元素配方为硫酸锰:4.0-8mg/L，硫酸锌:0.5-0.8mg/L，钼酸:0.1 -0.5mg/L，硫酸铜:0.l-0.8mg/L，硼酸:10-15mg/L;
[0049]培养控制条件:
[0050]温度:30-35。。，罐压:0.03-0.08MPa，风量:1.0-2.0vvm，DO 2 20 %，pH: 5.5-7.5。
[0051](3)将步骤(2)小球藻培养24小时，碳源耗尽溶氧反弹，测定藻液干重21.5g/L，PH:7.0时，取无菌样镜检、无菌培养正常，接入1.5方罐中；
[0052]1.5方种子罐定容I方；
[0053]培养基配方:
[0054]葡萄糖:30-60g/L，硫酸镁:0.5-1.6g/L，柠檬酸钙:0.1-0.5g/L，磷酸钠:1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾:0.3-0.8g/L，硫酸亚铁:0.05-0.lg/L,乙二胺四乙酸二钠:0.3-0.6g/L，尿素:3-8g/L，微量元素，水；
[0055]其中微量元素配方为硫酸锰:4.0-8mg/L，硫酸锌:0.5-0.8mg/L，钼酸:0.1-0.5mg/L，硫酸铜:0.l-0.8mg/L，硼酸:10-15mg/L。
[0056]培养控制条件:
[0057]温度:30-35°C，罐压:0.03-0.08MPa，风量:1.0-2.0vvm,D0>20% ,pH:5.5-7.5；
[0058](4)步骤(3)小球藻培养24小时，碳源耗尽溶氧反弹时，藻液干重能达到22.5g/L，PH: 6.9时，取无菌样镜检、无菌培养正常时，接入17方罐中；
[0059]17方种子定容9方；
[0060]培养基配方:
[0061 ]葡萄糖:30-60g/L，硫酸镁:0.5-1.6g/L，柠檬酸钙:0.1-0.5g/L，磷酸钠:1.0-2.0g/L，磷酸氢二钾:0.3-0.8g/L，硫酸亚铁:0.05-0.lg/L,乙二胺四乙酸二钠:0.3-0.6g/1，尿素:3-88/1^，微量元素，水。其中微量元素配方为硫酸锰:4.0-811^/1^，硫酸锌:0.5-