体外诊断方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于在体液中测定巯基嘌呤S-甲基转移酶的酶活性的体外方法。 具体地，本发明涉及这样的一种方法，其中尿硫酮（Urothione)含量和/或朱卡硫酮 (jukathione)含量在血衆、血清和/或尿中体外测定，以便测定疏基噪呤S-甲基转移酶的酶 活性。进一步地，本发明涉及一种尿硫酮和/或朱卡硫酮作为生物标记物的体外诊断方法。
【背景技术】
[0002] 巯基嘌呤S-甲基转移酶（下文主要称为TPMT)是在各种形式的白血病和慢性炎症 性疾病的治疗的药物代谢中的关键酶。TPMT将细胞抑制药物(例如6-巯嘌呤)转化为临床上 不活跃的甲基化形式（例如6-甲基巯嘌呤），再经肾排除。尽管TPMT具有下文所述的药理学 重要性，但是它的生理底物和TPMT在人类代谢中的作用是未知的。
[0003] 巯基嘌呤，例如6-硫鸟嘌呤(6-TG)、6_巯嘌呤(6-MP)或咪唑硫嘌呤(AZA)，是广泛 用于白血病（例如急性淋巴细胞白血病）、自体免疫疾病（例如克罗恩氏病、类风湿性关节 炎）的治疗以及用于器官移植的接受者的嘌呤拮抗物。它们是天然生成的核酸碱基鸟嘌呤 的类似物。巯基嘌呤的其他适应症是，例如，非霍奇金淋巴瘤，溃疡性结肠炎，真性红细胞增 多，银肩病关节炎，各种自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮，遗传病的疾病，其他形式的 血管炎，自身免疫性肝炎，特应性皮炎，重症肌无力，视神经脊髓炎(德维克氏病），限制性肺 病。
[0004] TPMT是甲基化巯基嘌呤化合物的酶。更具体地，TPMT催化巯基嘌呤剂的S-甲基化。 甲基供体是S-腺苷基-L-蛋氨酸，其又通过反应被转化为S-腺苷基-L-高半胱氨酸。也就是 说，TPMT利用S-腺苷基-L-蛋氨酸作为S-甲基供体来使巯基嘌呤剂代谢，同时形成作为副产 物的S-腺苷基-L-高半胱氨酸。
[0005] 影响TPMIi酶活性的遗传多态性与巯基嘌呤药物在患者治疗中的响应和副作用相 关。
[0006] 巯基嘌呤S-甲基转移酶（TPMT;EC 2.1.1.67)是催化巯基嘌呤药物如硫唑嘌呤 (AZA)和6-巯基嘌呤(6-MP)的S甲基化的胞内酶。酶活性本身显示在红细胞(RBC)中差异极 大，大约是200个高加索人中有1个完全缺乏，而11 %显示中间状态，89 %显示正常TPMT活性 (schaeffeler et al.2004)。此外，1-2%的高加索人偏离这个多峰分布，表现出非常高的 水平(Schaeffeler et al. 2004)。由于巯基嘌呤为主的免疫抑制剂只提供相对有限的治疗 范围，因此TPMT多态性显著地影响两个甲基化代谢物6-甲基巯嘌呤（甲基嘌呤核糖核苷酸） 和硫鸟嘌呤核苷酸(所谓的6-TGN)的比值，从而确定巯基嘌呤在患炎症性肠病、急性淋巴细 胞白血病和其他疾病(summarized in Teml et al.2007)的病人中治疗的有效性和毒性。 例如硫唑嘌呤或6-MP标准剂量治疗期间，具有减少或缺乏TPMT活性的个体的骨髓抑制的风 险增加，因为在这些情况中存在过高的6-TGN水平。因此，这些患者需要在巯基嘌呤治疗中 单独地调整剂量(Kaskas et al Gut 2002)
[0007] 相比之下，具有非常高水平的TPMT活性的个体处于发展治疗抗性（由于过低的6- TGN水平)的危险之中，因为巯基嘌呤代谢物的密集的甲基化发生在这些情况中，并且为此， 活性的6-TGN代谢物以较小的量形成。此外，肝脏损伤可由高6-甲基巯嘌呤核苷酸水平 (Dubinsky et al.2000, Nygaard et al.CPT 2008)引起。急性淋巴细胞性白血病和高水平 TPMT活性的儿科患者在标准条件下复发的风险增加 (Stanulla et al.2005)。
[0008] TPMT缺陷的分子机理很容易理解。TPMT构成为数不多的几个例子之一，其中药物 遗传现象被译为对于最佳巯基嘌呤剂量的调整普遍公认的诊断性的常规实验。这些建议最 近得到了更新(Relling et al.2013)，尽管现在仍不知TPMT的内源性底物。
[0009] TPMT活性通常在红细胞(RBCs)中测定。非常低的、中间的和正常的活性的截断值 被限定，所述截断值强烈依赖于所使用的测量方法例如福射化学测定(Weinshilboum et al. 1978)或基于HPLC的方法(Kroplin et al. 1998)。
[0010] 在1980年代，TPMT缺陷的遗传基础被提出（Weinshilboum et al. 1980)。现在，与 变异的TPMT活性相关的27种单核苷酸多态性(SNP)被描述(Appell et al.2013)。共同发明 人Dr. Schaef feler和Dr. Schwab研究了在大型的健康、自愿测试主体的人群中的TPMT基因 型-表型关系（1222个人）。他们能够证实TPMT表型的三峰分布，并发现个体的0.6% (1:180) 有TPMT缺陷，10.2%为TPMT活性中等水平，以及89.2%是正常的或高水平(Schaeffeler et al Pharmcogenetics 2004)。
[0011]当使用基因分析预测正确的TPMT表型时，TPMT基因型和表型之间的一致性是 98.4 %，对于阳性和阴性预测的敏感性和特异性大于90 %。虽然如此，在RBCs中的活性测定 和临床常规TPMT基因检测中有很大的局限性：（1)因疾病相关的贫血在最近的6-8周内接受 输血的患者中的正确TPMT表型的测定有误分类的高风险（Cheung et al.2003;F〇rd et al.2004，Schwab et al.2001)。因此，进一步的基因分析在所有的这些情况中都是极其重 要的。（2)在日常生活中，TPMT基因型的基因分析还未通过测序技术进行，因而仅仅检测已 知的惯常突变。因此，由于很少出现的等位基因未被分析而导致的误分类可能发生。
[0012] 基于上述理由，专一地被TPMT甲基化的内源性底物的识别对于改善的临床诊断来 说具有最重大的意义和最大价值。这样的直接生物标记物将消除所有的上述限制，并将不 仅在血液中，在尿中也是可检测的，这会显著地简化临床诊断。
[0013] 因为在对患急性淋巴细胞白血病儿童采用6-MP处理的常规治疗（Relling et al.2013)中TPMT分析是必需的，所以在这组患者中，更简单的尿分析实际上将非常有利。此 外，大约1-2%的个体的特点是TPMT活性增加；目前仍然不知道潜在的遗传成因。TPMT的内 源性反应产物的测定也将有效地识别非常高水平的TPMT活性的患者（Schaeffeler et al. 2004)，从而降低或消除硫唑嘌呤或6-MP治疗由于过低的剂量导致的较差的响应的风 险。
[0014] 此外，TPMT缺陷与顺铂的毒性相关，因此，还建议在顺铂治疗之前进行TPMT的基因 分析(Ross et al. 2009)。这些患者也将从内源性TPMT产物的简便快速测定中获益。
[0015] 由于副作用的风险，治疗前，通过基因和酶分析检查儿科白血病患者的TPMT活性。 目前这些检验涉及许多努力，因而通常仅仅在特别濒危的病人组如儿科患者中常规进行， 然而其他病人组，例如慢性炎症性疾病的患者，最为常见的是首先用次优剂量，以便避免毒 性。除其他以外，通过在具有降低的和非缺少的TPMT活性的患者中增加剂量，以经验为主地 逐步接近患者可忍受的最大的巯基嘌呤剂量。在这个过程中，一方面，因药量过大总是有严 重的或甚至致命的副作用的危险，另一方面有药量不足的危险，其危害治疗的成功。
[0016]非专利文献
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