一种mthfr、mtrr和rfc1基因多态性检测引物组合物、试剂盒及其应用
【技术领域】
[00011本发明涉及一种多重基因检测试剂盒及其应用，尤其是涉及一种MTHFR、MTRR和RFC1基因多态性检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]叶酸属B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物 质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，叶酸缺乏是导致出 生缺陷的主要原因。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血 压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。
[0003]而中国是世界上出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的 20%。近年来大量研究已经证实，孕妇叶酸缺乏是导致出生缺陷的主要原因之一。怀孕时补 充叶酸除了能预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内 发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等的发病率。另外，男性的叶酸摄入不足，机体叶酸 水平偏低，会引起两方面的不良后果:一是精子密度低、活性下降、勃起功能减弱，二是精液 中携带的染色体数量异常(过多或过少，即精子中出现"非整倍体"），导致胎儿流产或新生 儿唐氏综合症发生。因而，男性在妻子怀孕之前和女性怀孕期间保持足够的叶酸水平，对胎 儿的健康发育有重要影响。科学研究证实，与甲基类维生素(叶酸及维生素B12)代谢密切相 关的是MTHFR、MTRR和RFC1基因的4个SNP(单核苷酸多态性)位点，基因突变时其编码的叶酸 代谢关键酶活性降低，叶酸代谢障碍，导致神经管畸形、先天性心脏病、唇腭裂等出生缺陷 发生。
[0004]现有的用于单核苷酸多态性（SNP)检测方法主要为基因芯片、荧光定量PCR及 Sanger测序法。
[0005] (1 )qPCR检测方法:采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点变异设计特异 性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强。其缺点是（1)通量低:不适宜多SNP位点的检测;难 以设置内控基因。（2)成本较高:探针标记成本高;若需获得所有相关SNP信息，需进行多个 检测试验，叠加成本更加昂贵。
[0006] (2)基因芯片法:基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序 列的DNA片段(基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA 探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进 行快速定性和定量分析。DNA芯片：由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，依靠野生 型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测。其优点是：（1)高通量并行检测； (2)操作简便快速:整个检测只需4-8小时基本可以出结果。缺点：1)不同SNP位点之间的杂 交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制；2)技术成本昂贵、复杂:每个 样品需要一个芯片，成本大于Y1000/样品，不利于大规模推广;探针的合成与固定比较复 杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤;3)重复性差，准确性低，易出现假阳 性假阴性结果;4)灵敏度较低:芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较 多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而 影响检测的灵敏度;5)由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。
[0007] (3)Sanger(双脱氧链终止法)测序法：Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开 始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获 得可见的DNA碱基序列。其优点是SNP分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。缺点 是每个样本的每个位点均需要经PCR扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。步骤多而分散，成 本较高，工作量大，周期长，多个SNP位点检测累计价格相对昂贵。
[0008]本发明的多重SNP位点检测方法基于多重PCR和毛细管电泳(CE)分离技术。采用多 重PCR方法，在同一个反应管中同时加入2 1对特异性基因扩增引物及反应内参引物，根据 基因扩增片段的大小用毛细管电泳分离分析多个SNP位点及基因型，能快速有效地检测多 个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷，具有以下优势：
[0009] 1、高通量:本系统实现单个反应检测30-40个位点。
[0010]2、准确性强:采用CE对PCR产物进行分离，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和 特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；
[0011] 3、敏感性高，结果重复性好:本系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的 偏差，提高了对一套目的基因进行定性的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超高 灵敏度；
[0012] 4、方法简便，使用经济:本发明提供从试剂、多重PCR引物设计、结果分析等全套实 验方案;每个样品的检测成本少于Y50，利于大规模推广；
[0013] 5、灵活性强:可随时根据需求调整检测的靶基因。
[0014] 6、易于实现自动化。
[0015]目前，国内外还没有关于基于多重PCR和CE分离的多重SNP检测指导叶酸用药的试 剂盒及其检测方法的相关报道。
【发明内容】
[0016] 本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、准确度高、通量高、可靠性强、 成本低、无假阴性结果的基于多重SNP检测系统的MTHFR(rsl801131和rsl801133)、MTRR (rsl801394)和RFCl(rsl051266)基因多态性检测引物组合物。
[0017] 本发明解决的技术问题还在于，提供包含上述引物组合物的MTHFR、MTRR和RFC1基 因多态性检测试剂盒、及该试剂盒的应用。
[0018] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
[0019] -种MTHFR、MTRR和RFC1基因多态性检测引物组合物，所述的引物组合物包括以下MTHFR、MTRR和RFC1基因上的4个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物，其基因序列如 下表，表1所示：
[0020] 表 1
[0021]
[0022]其中，A/C表示该SNP位点有两种可能基因型A或C，两条反向引物分别指检测该SNP位点相应基因型A或基因型C的引物，在检测该SNP位点时两条引物要同时加到反应液中，C/ T表示该SNP位点有两种可能基因型C或T; A/G表示该SNP位点有两种可能基因型C或T。
[0023]上述MTHFR基因上rsl801131片段的A型基因的反向扩增引物与C型基因的反向扩 增引物均采用核酸序列SEQID勵.3:6664了64六〇^666了〇：〇^(：;]?1'册1?基因上^1801133片 段的C型基因的反向扩增引物与T型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQIDN0.6: GGCTCTCCTGGGCCCCTCAC; MTRR基因上rs 1801394片段的A型基因的反向扩增引物与G型基因 的反向扩增引物均采用核酸序列SEQIDN0.9:AACAAACACATTTCTGTTAAAA;RFC1基因上 rsl051266片段的A型基因的反向扩增引物与G型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ IDNO.12:TATTCCAGACGCTGCTCCCC。
[0024] 进一步的，本发明所述的一种MTHFR、MTRR和RFC 1基因多态性检测引物组合物，还 包括DNA内参的正反向扩增引物和反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如下表表2所 示：
[0025]表2
[0026]
[0027]本发明所述包括上述引物组合物的MTHFR、MTRR和RFC1基因多态性检测试剂盒，还 包括超纯水(ddH20)、X溶液、10XPCR缓冲液，25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品；所 述的X溶液包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物。
[0028]所述的X溶液包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物和1个质粒pcDNA3.1( +)，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO. 21所示;反向扩 增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID N0.22所示;所述的通用引物正向扩增引物 带荧光标记。
[0029]所述的阳性对照品为克隆到载体PMD18-T上的11个DNA片段。所述的11个DNA片段 分别为包含有SNP位点上rsl801131的A型基因和C型基因、rsl801133的C型基因和T型基因、 rs1801394的A型基因和G型基因、rs1051266的A型基因和G型基因及人类基因NCAM2、 ARHGEF7 和RNaseP的片段。
[0030]一种利用MTHFR、MTRR和RFC1基因多态性检测试剂盒的使用方法，具体包括以下步 骤：
[0031] (1 )DNA样品的收集和提取
[0032]将刮取到口腔上皮细胞的口腔拭子放入300yL DNA裂解缓冲液中，在恒温混匀仪 中于95°C，lOOOrpm的条件下，处理5分钟后取出，室温放置至冷却，然后在样品中加入30yL 提取缓冲液，混匀，12000g离心5分钟，得到的上清液即为PCR的DNA样品模板；
[0033] (2)以提取的核酸为模板进行PCR反应
[0034]取DNA样品2yL，10 X PCR缓冲液2yL，25mM的氯化镁3.4yL，PCR引物溶液2yL，DNA聚 合酶2yL，X溶液2yL，超纯水6.6yL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件:42°C 5分钟，95°C 3分钟，94°C 30秒钟，60°C 30秒钟，70°C 1分钟，3到5步循环35次;72°C3分钟； 4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物和1 个质粒pcDNA3.1 ( + )，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA;反向扩增 引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记;PCR引物溶 液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括以下3个与叶酸代谢基因上的4个SNP位 点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩 增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO. 1~N0.20所示；
[0035](3)GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
[0036] 取PCR产物0.1-lyL，上样缓冲液38.75yL，DNAMarker0.5yL，矿物油一滴混合均 匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将遗传分析仪的软件获得的图谱与标 准图谱对比，获得与叶酸代谢基因相关的SNP位点的等位基因型。
[0037]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明是一种MTHFR、MTRR和RFC1基因多态 性检测试剂盒及其检测方法及其检测方法，本试剂盒及检测方法基于多重PCR和毛细电泳 技术，利用不同长度的PCR特异性扩增片段来鉴定区分不同的基因，创立了一种同步检测 MTHFR、MTRR和RFC1三个基因的四个SNP位点上的不同基因型的检测方案，以指导叶酸的合 理补充剂量，本方法优化多重PCR反应体系，对待测DNA样品进行特异性扩增，再用毛细电泳 方法分离PCR扩增产物以鉴别不同的基因和基因型，其一天之内可完成192个患者样品的检 测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间；反应内参的使用可用 于监测整个反应系统、PCR反应的效率，避免假阴性。
[0038] 综上所述，本发明是基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的MTHFR、MTRR和RF