一种大曲霉菌数量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大曲霉菌数量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 大曲是中国白酒生产的糖化发酵剂，它主要是为白酒发酵富集微生物，提供以糖 化酶为主的各种酶类和各种香味前驱物质，是白酒香味成分的重要来源。大曲的生产原理 就是最大限度地让适合于发酵的有益霉菌生长繁殖。由于霉菌的结构和形态独特，可以使 大曲在培养过程中形成各种颜色，人们把曲块中的各种颜色叫做"五色衣"，并说"五色衣不 成，则难收好曲"，在很大程度上，大曲的质量是由其颜色来判定的。由此可见霉菌对大曲的 重要性。大曲中的霉菌主要是曲霉（黑曲霉、红曲霉、米曲霉）、根霉、毛霉、犁头霉、青霉等。 由于大曲生产是在特殊的自然生态环境条件下，靠传统工艺自然接种，通过网罗自然界中 的各种微生物在上面生长而成的，因此，大曲中的微生物类群极为丰富，是多种微生物的混 合体系。
[0003] 大曲药的生产原料主要是小麦，是将小麦粉碎后加水压坯，再经自然发酵而成，所 以，传统检测大曲药霉菌数量常规采用GB4789.15-94,《中华人民共和国国家标准食品卫生 微生物检验霉菌和酵母计数》，其检测手段主要包括平板计数法与直接镜检计数法。由于两 种方法检测的对象不一致，平板计数的检测对象是活菌体，而镜检计数的检测对象是活菌 体和死菌体。虽然镜检计数法具有直观、快速的优点，但由于此法计得的是活菌体和死菌体 的总和，对于需要了活菌体数量的大曲药样品来说，采用镜检计数法检测的结果没有实际 意义，因此，对于大曲药样品霉菌数量的检测通常采用平板计数。
[0004] 然而，除了采取恰当的计数方法以外，如何选取合适的培养基对于检测结果的准 确性也极为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能够使检测结果更准确的大曲霉菌数量的检测方法。
[0006] 一种大曲霉菌数量的检测方法，选用PDA培养基、察氏培养基、豆芽汁葡萄糖或蔗 糖琼脂培养基或淀粉培养基来检测大曲药中霉菌数量。
[0007] 进一步地，如上所述的检测方法，选用PDA培养基来检测大曲药中霉菌数量。
[0008] 进一步地，如上所述的检测方法，在所述PDA培养基中添加有广谱抗生素。
[0009] 进一步地，如上所述的检测方法，所述广谱抗生素为:青霉素、链霉素、氯霉素或青 霉素与链霉素的混合。
[0010]进一步地，如上所述的检测方法，在DA培养基中添加有青霉素与链霉素各40u/ml。
[0011]本发明考虑到曲药中微生物数量大、种类复杂，为了减少不同种群微生物间的相 互干扰，我们采用在roA培养基中添加抑制革兰氏阳性菌的青霉素与抑制革兰氏阴性菌的 链霉素，两种抗生素协同作用，完全抑制细菌的生长，让所有霉菌尽可能得以生长繁殖，使 检测结果更准确。
【具体实施方式】
[0012] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0013] 粮食中霉菌数量检测常用培养基
[0014] 现有研究表明，大曲药中的微生物主要有含有霉菌、细菌、酵母菌与放线菌，其中 霉菌和细菌数量一般在1X1(Γ7个/克.干曲左右，多的可以上亿个/克.干曲，酵母菌数量一 般比前者低2-3个数量级，放线菌在部分大曲中有少量存在。面对这样一个复杂的微生物混 合体系，要比较真实的检测出其中的霉菌活菌数量，除了采用有效的检测方法外，还得有目 的性地设计出相应的选择性培养基。目前检测粮食中霉菌数量的培养基主要有以下几种可 采用:察氏培养基;马铃薯葡萄(PDA)琼脂培养基;豆芽汁葡萄糖(或蔗糖)琼脂培养基;淀粉 培养基。以下，我们以菌落数量、种群及单离效果等指标，综合评价这几种培养基对大曲药 中霉菌的检测效果。
[0015] 粮食中霉菌数量检测常用培养基对大曲药的检测效果
[0016] 大曲药中霉菌在TOA培养基、察氏培养基、豆芽汁葡萄糖(或蔗糖)琼脂培养基、淀 粉培养基等培养基上的生长情况见表1。从表1、表2看出，察氏培养基对霉菌的分离效果好， 但可能由于这种培养基营养成分不全面，造成部分种类的霉菌生长较差或难生存，菌落形 态不分明，给计数、分离带来一定困难;另外3种培养基，由于营养成分丰富，适合多种类群 的微生物生长，造成霉菌的单离效果较差，相比之下，PDA培养基上霉菌种群和数量多于豆 芽汁葡萄糖琼脂培养基与淀粉培养基。故从上述几个指标综合考虑，检测大曲药中霉菌指 标选用PDA培养基为宜。
[0017]表1常用霉菌培养基对大曲药霉菌的检测效果
[0018] (25°C培养 48h,单位：cfu/g曲）
[0019]
[0020] 注："ND"表示未检测出菌落(下同）
[0021] 表2常用霉菌培养基对大曲药霉菌的检测效果
[0022] (25°C培养 72h,单位：cfu/g曲）
[0023]
[0024] 大曲中霉菌检测所用抗生素的选择
[0025] 选用PDA培养基检测大曲药霉菌会有部分细菌生长，由于细菌生长会抑制和掩盖 霉菌菌落，造成霉菌检测结果偏低。因此，我们利用抗生素对细菌的抑制作用，在PDA培养基 中尝试添加不同剂量的青霉素、链霉素、氯霉素等广谱抗生素，所有平板采用同一稀释度进 行抗生素的抗菌试验，试验结果如下表3-表9。
[0026]表3氯霉素对中温曲中细菌的抑制效果(培养48h)
[0027]
[0028] 表4氯霉素对中温曲中细菌的抑制效果(培养72h)
[0029]
[0031] 表5链霉素对中温曲中细菌的抑制效果(培养48h)
[0032]
[0033] 表6链霉素对中温曲中细菌的抑制效果(培养72h)
[0034]
[0036] 表7青霉素对中温曲中细菌的抑制效果(培养48h)
[0037]
[0038] 表8青霉素对中温曲中细菌的抑制效果(培养72h)
[0039]
[0040]表9青、链霉素对中温曲中细菌的抑制效果(培养48h)
[0043] 表3-表9表明，PDA培养基中链霉素、氯霉素含量，达到20u/ml时，基本能抑制细菌 的生长;青霉菌素含量达到60u/ml时，能抑制所有细菌生长;抗生素含量在1000u/ml以下， 对霉菌的生长没有影响。但已有的研究表明，青霉素属于β-内胺酰类抗生素，不仅对革兰氏 阳性菌有(葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、丙酸杆菌、真杆菌、乳酸杆菌等)有强大的抗菌作 用，对一些革兰氏阴性菌也有较强的作用;链霉素属于氨基糖苷类抗生素，主要对一些革兰 氏阴性菌有较强的抗菌作用;氯霉素主要对一些革兰阴性杆菌作用强。上述3种抗生素虽然 都是广谱抗生素，但由于各自作用的主要对象不同，综合上述试验结果，我们试用青霉素与 链霉素混合抗生素来抑制大曲霉菌的生长，采用〇、40、60u/ml等含量的两种混合抗生素分 别对中温大曲和高温大曲进行测试，其结果(表10-表11)表明，青霉素、链霉素、氯霉素单一 使用，对大曲细菌的抑制效果不如青霉素与链霉素混合使用效果好，试验证明青霉素+链霉 素含量达40ug/m以上时，能抑制大曲药中细菌的生长，减少了细菌对霉菌拮抗作用，有利于 大曲药中霉菌计数与菌种分离，且抗菌素的添