一种产朊假丝酵母细胞生物催化制备(s)-3-羟基-3-（4-甲基苯）丙酸甲酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到产朊假丝酵母细胞生物催化制备手性 医药中间体(S)-3-羟基-3-(4-甲基苯)丙酸甲酯的技术。
【背景技术】
[0002] 手性(S)_3_羟基_3_(4_甲基苯)丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和 其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优 点，作为绿色高效制备手性化合物的优先途径，被越来越多地应用于生产一些高附加值的 手性化合物。生物催化制备手性(S)-3-羟基-3-(4-甲基苯)丙酸甲酯具有很好的应用前景。 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点，是可持续发展 过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化 最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中，水解酶能够催化动力学拆分外 消旋体得到手性产品，在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来，氧化还原酶在工 业上的应用得到了迅速增长。目前，采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工 业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。 生物还原法相对于动力学拆分法而言，最大的优势在于理论收率可达100%，原子经济 性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与，一定程度上限制了其应用。由于辅酶依 赖性的缘故，生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂，实现体内辅酶循环再生的同时免 去了酶的分离纯化步骤。 (S)-3-羟基-3-(4-甲基苯)丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性 砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺 陷，难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备(S)-3-羟基-3-(4-甲基苯)丙酸 甲酯。
【发明内容】
[0003]本发明采用产朊假丝酵母细胞催化制备（S)-3_羟基-3-(4-甲基苯)丙酸甲酯，反 应式如下：
底物3-(4-甲基苯)-3-丙酸甲酯（1)经产朊假丝酵母催化反应，得到产物(S)-3-羟 基-3-(4-甲基苯)丙酸甲酯(2)。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确 定采用产朊假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量率 (ee%)均很高。 许多产朊假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验， 本发明选用产朊假丝酵母菌株为ATCC64882，其催化反应效果最佳。 由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型，而细胞本身所含有的辅酶量可能较 少，因此，进行氧化还原反应时，为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中还添加辅 助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同，效果差别 很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳的辅助底 物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为:木糖30_33g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖36-41g/ L、异丙醇8-10%V/V(体积浓度）。 由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。 培养介质： 1、 种子培养基成份为：酵母提取物1〇〖/1，葡萄糖208/1，蛋白胨208/1，？!1为5.6 ; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。 2、 培养液成份：葡萄糖 20-22g/L，麦芽浸膏 23-25g/L，（NH4)2S〇4 4.8-5.3g/L， KH2PO49-11g/L，MgS〇4.7H2〇 0.3-0.4g/L，CaCl20.35-0.4g/L,硫酸铵0.2-0.25g/L，硫 酸镁 0.3-0.4g/L，pH为 5.6。 2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。 酵母细胞制备。产朊假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵罐加入培养 液，装料系数为0.6-0.7，121°C高压灭菌30分钟，冷却至28-29°C，将产朊假丝酵母种子液接 种至发酵罐，接种比例为6-6.5 %，通气比为1.7-1.8VAV分钟），28-29°C培养39-43小时，用 过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。 生物催化转化 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为5.6，加入底物3-(4-甲基苯)-3-丙酸 甲酯，使底物浓度为80-90g/L。其他成份:麦芽浸膏22-26g，支链化13碳格尔伯特醇聚氧 乙烯醚21-22g/L，木糖30-33g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖36-41g/L、异丙醇8-10%V/V(体积浓 度），121°C高压灭菌30分钟;冷却至28-29°C时，加入湿酵母细胞使浓度为67-71g/L，通气比 为0.15-0.16VAV分钟），即每分钟通气量为0.15-0.16倍反应液体积，进行生物催化反应， 反应时间为59-64小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得 到产物（S)-3-羟基-3-(4-甲基苯)丙酸甲酯，反应转化率98-99%，产品收率96-97%，对映 体过量率98.5-99%。 本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反应介 质选择和浓度优化，包括底物浓度、麦芽浸膏含量、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度 等。 实施例1 种子培养基成份为：酵母提取物1〇〖凡，葡萄糖20〖凡，蛋白胨20〖/1，？!1为5.6;配 制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。 培养液成份为:葡萄糖20g/L，麦芽浸膏23g/L，木糖6g/L，（NH4)2S〇4 4.8g/L，KH2P〇4 9g/L，MgS〇4.7H20 0.3g/L，CaCl2 0.35g/L，硫酸铵0.2g/L，硫酸镁0.3g/L，pH为5.6。 湿酵母细胞制备过程如下:产朊假丝酵母ATCC64882经斜面、摇瓶培养，得到种子液。 10L发酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却至28-29°C，将产朊假丝酵母种子液接 种至发酵罐，接种比例为6%，通气比为1.7VAV分钟），28-29°C培养39小时，用过滤式离心 机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。 生物催化转化:. 5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为5.6，加入底物3-(4-甲基苯)-3-丙酸甲酯，使浓度为80g/L，麦芽浸膏22g，支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙 烯醚21-22g/L，木糖30-33g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖36-41g/L、异丙醇8-10%V/V(体积浓 度），121°C高压灭菌30分钟;冷却至28-29°C时，加入湿酵母细胞使浓度为67g/L，通气比为 0.15V/(V分钟），进行生物催化反应，反应时间为59小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙 酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物（S)-3-羟基-3-(4-甲基苯)丙酸甲酯，反应转化率 99 %，产品收率97 %，对映体过量率98.5 %。 实施例2 种子培养基成份为：酵母提取物1〇〖凡，葡萄糖20〖凡，蛋白胨20〖/1，？!1为5.6;配 制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。 培养液成份为