一种dna探针组合和试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物检测领域，更具体地，涉及一种DNA探针组合和包括该DNA探针组 合的试剂盒。
【背景技术】
[0002]微小RNA(miRNA)是一类小分子调控RNA，在肿瘤的发生与控制方面发挥着重要的 作用。已经发现在肿瘤患者的循环核酸中存在源自肿瘤的miRNA分子，这一现象提示循环 miRNA分子可能成为无创诊断癌症的一个有效的方法。研究表明miR-21，miR-145，miR-222， miR-223，miR-29a，miR-10b在肝癌肿瘤患者血清中明显过度表达，是评估疗效的潜在生物 标志物。miR-16的表达稳定，可作为内参。
[0003]目前已有的血清中miRNA的检测方法主要是实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
[0004] 但是这个方法需要先对miRNA进行逆转录，并且RT-PCR的过程需要完成高温变性， 低温复性，适温延伸的热循环。操作繁琐，并且需要使用大型昂贵的仪器。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种DNA探针组合和包括该DNA探 针组合的试剂盒。
[0006] 本发明的发明人拟利用RCA技术对血清中miRNA进行检测，DNA滚环扩增(RCA)技术 是一种等温信号扩增方法，可在室温下进行，使用两个引物就可实现指数滚环扩增，可用于 极微量生物标记物的检测。RCA能直接扩增DNA或者RNA分子，所以将其用于血清中miRNA的 检测具有快速、灵敏、特异的特点。此外，发明人发现如果只对某一特定的miRNA表达量进行 分析，很容易出现假阳性或假阴性的结果。
[0007] 基于此，本发明提供一种DNA探针组合，该DNA探针组合包括：
[0008] (1 )miR-223探针，所述miR-223探针为40-80nt的通过以下DNA序列5 '端和3 '端连 接而成的环状DNA模板：
[0009] 5'-GACAAACTGACA(SEQ ID N0:l)XiTGGGGTATTT-3(SEQ ID Ν0:2)'，Χι为任意序列 的DNA片段；
[0010] 和（2)miR-16探针，所述miR-16探针为40-80nt的通过以下DNA序列5'端和3'端连 接而成的环状DNA模板：
[0011] 5'-TACGTGCTGCTA(SEQ ID N0:3)X2CGCCAATATT(SEQ ID N0:4)-3'，X2为任意序列 的DNA片段；
[0012] 以及以下探针中的至少两种：
[0013] (3)miR-21探针，所述miR-21探针为40-80nt的通过以下DNA序列5'端和3'端连接 而成的环状DNA模板：
[0014] 5'-TGATAAGCTA(SEQIDN0:5)X3TCAACATCAGTC(SEQIDN0:6)-3'，X3为任意序列 的DNA片段；
[0015] (4)miR-29a探针，所述miR-29a探针为40-80nt的通过以下DNA序列5'端和3'端连 接而成的环状DNA模板：
[0016] 5'-AGATGGTGCTA(SEQIDN0:7)X4TAACCGATTTC(SEQIDN0:8)-3'，X4为任意序列 的DNA片段；
[0017] (5)miR-222探针，所述miR-222探针为40-80nt的通过以下DNA序列5'端和3'端连 接而成的环状DNA模板：
[0018] 5'-CAGATGTAGCT(SEQIDN0:9)X5ACCCAGTAGC(SEQIDN0:10)-3'，X5为任意序列 的DNA片段；
[0019] (6)miR-145探针，所述miR-145探针为40-80nt的的通过以下DNA序列5'端和3'端 连接而成的环状DNA模板：
[0020] 5'-GGAAAACTGGAC(SEQIDN0:11)X6AGGGATTCCTG(SEQIDN0:12)-3'，X6为任意序 列的DNA片段；
[0021] (7)miR-10b探针，所述miR-10b探针为40-80nt的通过以下DNA序列5'端和3'端连 接而成的环状DNA模板：
[0022] 5'-TTCTACAGGGTA(SEQIDN0:13)X7CACAAATTCGG(SEQIDN0:14)-3'，X7为任意序 列的DNA片段。
[0023] 根据本发明，优选地，各探针长度为50_70nt。
[0024] 根据本发明，各个探针中的任意序列可以为具有随机任意组合的一段DNA。
[0039] 理论上，用于检测的DNA探针数目越多，得到的结果的可靠性越高，但是基于简便 性的要求，所述DNA探针组合中的DNA探针数目至少为4个即可。
[0040] 本发明的上述DNA探针均为针对肝癌miRNA序列而设计。
[0041] 本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括以下组分：
[0042] (1)上述的DNA探针组合；
[0043] (2)RCA指数扩增引物；
[0044] (3)DNA聚合酶；
[0045] (4)dNTP；
[0046] (5)RCA反应液；
[0047] (6)DNA荧光染料；
[0048]其中，所述DNA探针组合中的各个DNA探针以相互独立的形式提供。
[0049] 本发明中，所述"各个DNA探针以相互独立的形式提供"的含义是指各个DNA探针不 混合在一起，并不排除每个DNA探针与其他组分混合在一起的情形。
[0050] 根据本发明，所述试剂盒包括的上述组分可以全部单独提供，也可以部分组合提 供，例如，每个探针可以与用于RCA指数扩增的引物、dNTP和RCA反应液共同以检测溶液的形 式提供，根据本发明，所述检测溶液的数目与所述DNA探针组合中DNA探针的数目相同。
[0051] 本发明的检测原理如下：针对待检测的miRNA，分别设计了可以特异性与目标 miRNA结合的DNA环状模板，以及用于RCA指数扩增的引物。miRNA结合到环状DNA上后，在DNA 聚合酶的作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状单链DNA。 用于RCA指数扩增的引物是一条与环状DNA的一段序列完全一致的引物（10-20个碱基），该 引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸，置换下游杂交到扩增产物上的其它拷贝段的 引物，其产物又可作为与环状DNA模板互补的引物。这样在很短的时间内，产物呈指数扩增。 [0052]最后将可以嵌入双链DNA的荧光染料加入扩增体系中，通过荧光信号的强弱对比 来判断血清中miRNA的含量高低。
[0053] 本发明中，所述RCA是指滚环扩增(rollingcircleamplification，RCA)，该术语 的含义和技术步骤为本领域技术人员公知。
[0054]根据本发明，所述DNA探针组合中每个探针的量为0.1-lnmol;形成的所述检测溶 液中，每个DNA探针的浓度为ΙΟΟ-ΙΟΟΟηΜ即可满足检测要求，进一步优选为200-600nM。
[0055] 本发明中的所述DNA聚合酶优选为Phi29DNA聚合酶。
[0056]根据本发明，所述DNA荧光染料的作用是对DNA进行快速检测，因此，可实现该目的 的DNA荧光染料皆可用于本发明。优选地，所述DNA荧光染料为SybrGreenDNA染料。该染料 可通过商购获得。
[0057]根据本发明，所述RCA反应液可以为商购DNA聚合酶时所带的反应缓冲液，也可以 为根据该反应原理配置而成的反应液。
[0058]根据本发明的原理，本领域技术人员能够设计合适的RCA指数扩增引物，如上所 述，所述RCA指数扩增引物是一条与环状DNA的一段序列完全一致的引物，通常为10-20个碱 基。根据本发明一种优选实施方式，每条探针序列都有一段共有的序列，可基于该序列设计 RCA指数扩增引物，例如，可以为5 ' -ATCAAAGCCCATACTACA-3 '（SEQIDNO: 22)。
[0059] 本发明的试剂盒可以实现肝癌的早期测定，操作简便，成本低。指数扩增的RCA反 应灵敏度高，特异性好。多个生物标记物miRNA的同时