一种从南极假丝酵母发酵上清液中固定脂肪酶b的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种固定南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的工艺方法，属于酶固定化领域。
【背景技术】
[0002]南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctic lipase B，CALB)来源于南极假丝酵母，是一种优良的脂肪酶，它对水溶性、非水溶性物质都有很强的催化活性，在有机合成、手性化合物拆分、医药中间体等领域得到广泛应用。
[0003]固定化脂肪酶与其液体酶制剂和粉末酶制剂相比，具有易于从反应体系分离、可装柱连续反应、稳定性高、易于控制等优势，适用范围十分广泛。酶的固定化方式分为共价结合、载体交联、吸附与包埋法，其中以吸附法最为简单实用，目前主流的CALB固定方法主要为吸附法。
[0004]吸附法分为水相吸附、有机相吸附、微水相吸附等，由于CALB的活性区域为疏水区域，因此有机相吸附能够保持活性区域外露，能够较好的保持脂肪酶活力，但成本较高，有机溶剂用量大，工艺较为复杂;水相吸附法工艺简单，成本较低，但会造成CALB活性中心的金属离子溶出，或在载体表面形成多层吸附而导致疏水区域叠加掩蔽，使CALB的酶活回收率降低。
[0005]目前诺维信公司生产的Novozyme435是最为成功的CALB固定化商品酶，由重组米曲霉发酵获得的CALB固定于大孔丙烯酸树脂制备，催化效果优秀但价格昂贵，限制了其在酶催化工业中的应用。国内固定化脂肪酶价格较为低廉，但普遍具有催化活性较低、稳定性较差或难以规模化生产的缺点，难以占据市场优势。中国专利申请号201510199817.0公布了一种固定化碱性脂肪酶的利记博彩app。该方法利用甘氨酸作为助剂，使用吸附法进行固定化酶的制备。
[0006]本发明使用较为廉价的载体，采用水相固定化方式，配合后处理工艺制备固定化南极假丝酵母脂肪酶B，提高了在水相吸附下的酶活回收率，在成本和使用效果方面进行平衡，对CALB的工业应用具有重要意义。
[0007]现有技术通常用为微水相固定化，本发明为水相直接固定，原理不同，收益在于有机溶剂用量小，使用发酵液上清，酶仅需初步纯化;本发明固定化载体与现有技术不属于同一系列，收益在于固定化效率更高，降低综合成本;现有技术后处理不包含本发明的锌离子处理内容，且步骤、原理均不相同，本发明收益在于能够提供酶活性中心，解除酶的相互遮蔽作用，提高酶活收率;现有技术使用冷冻干燥进行处理，本发明使用沸腾干燥及真空干燥，收益在于设备要求低，能耗低；与现有技术相比，本发明已进行中试、生产级别放大，且容易工业化操作，收益在于与生产关联程度较高，易于放大规模。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的问题是:提供工艺流程简单，生产成本较低，易于工业化生产的一种固定南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的工艺方法，并通过适当的后处理方法提高固定化酶的活力和有机相中使用的稳定性。
[0009]本发明提供一种从南极假丝酵母发酵上清液中固定脂肪酶B的方法，，具体步骤如下:
[0010]1)发酵液预处理
[0011]所述方法中，南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的活力范围为2000?2400U/mL，降温预冷至15?20°C。
[0012]2)树脂的预处理
[0013]使用NKA-1I大孔树脂作为预柱填料，按照树脂与发酵上清液体积比1:5?8，使用甲醇进行湿法装柱，装柱量0.7?0.8BV，预柱径高比1:5?10，使用2倍树脂体积甲醇作为流动相进行清洗，流速1?1.5BV/h，甲醇清洗后使用3倍柱体积的蒸馏水将甲醇洗出，流速1?1.5BV/ho
[0014]使用HPD600大孔树脂作为吸附柱填料，按照树脂与发酵上清液体积比1:8?15，使用甲醇进行湿法装柱，装柱量0.7?0.8BV，吸附柱径高比1:5?15，使用2倍树脂体积甲醇作为流动相进行清洗，流速1?1.5BV/h，甲醇清洗后使用3倍柱体积的蒸馏水将甲醇洗出，流速1?1.5BV/h。
[0015]3)吸附操作
[0016]吸附条件:使用预冷的发酵上清液，上样流速以吸附柱计为0.2?0.4BV/h，先后通过预柱和吸附柱。
[0017]终点判断:预柱出口处取样检测过柱液的总蛋白浓度，观察树脂颜色，蛋白浓度发生阶跃，树脂完全变色时预柱饱和，应切换至未使用的预柱，并对使用后的预柱进行再生。吸附柱出口处取样检测过柱液的脂肪酶B活力，当酶活力发生阶跃，树脂完全变色时判断为终点，切换至未使用的吸附柱，并对当前吸附柱进行后处理。
[0018]4)吸附柱的后处理
[0019]碱洗:使用蒸馏水配制NaOH稀溶液，使NaOH稀溶液的pH = 8.0?8.5，使用0.8?1.0BV的NaOH稀溶液，以1.0?1.5BV/h的流速冲洗已经至吸附终点的吸附柱。
[0020]锌离子缓冲液浸洗:使用pH=6.0?6.5，浓度为0.lmol/L的磷酸缓冲系，配制锌离子浓度为0.0lmol/L的氯化锌溶液，使用1.0?1.2BV的上述含锌离子缓冲液将树脂从吸附柱中洗出，浸洗10?15min，过滤并收集树脂。
[0021 ]水洗:收集的树脂置于抽滤器中，用0.2?0.5倍树脂体积的蒸馏水进行漂洗，抽滤，收集树脂。
[0022]干燥:湿树脂在45°C下进行沸腾干燥，干燥时间30?75min，收集干燥树脂。
[0023]5)干燥树脂的有机相处理
[0024]配制十八烷与石油醚比例为1:100(v: V)的石油醚体系，使用1.0?1.5倍干燥树脂体积的上述石油醚与干燥树脂混合，搅拌30?45min，过滤收集树脂，30°C下进行真空干燥，干燥时间30?75min，收集干燥树脂，即得固定化南极假丝酵母脂肪酶B。
[0025]本发明的有益效果:
[0026]1、本发明利用NKA-1I大孔树脂对蛋白质的吸附性以及其对脂肪酶B吸附能力极弱的特性对南极假丝酵母发酵上清液进行初步纯化，利用HPD600大孔树脂对杂蛋白吸附能力低但对脂肪酶B吸附能力高的特性进行脂肪酶B的固定，简化了酶的纯化步骤，降低处理成本。
[0027]2、本发明中制备固定化酶的方法，采用固定床的方式对酶进行吸附，易于判断终点，并可以通过色谱柱之间的切换进行连续操作，同时解决了水相固定条件下酶活收率低，母液中游离酶利用率低的问题。
[0028]3、本发明利用锌离子为脂肪酶B提供活性中心，利用含十八烷石油醚的疏水作用减弱了酶活性中心的排阻作用，提高了固定化酶的活力，增强了其在有机介质中的催化能力。
[0029]4、本发明中所制备的固定化脂肪酶粒径分布为0.3?1.25mm，便于从反应体系中分呙。
[0030]5、本发明中所制备固定化脂肪酶稳定性良好，适合循环使用。
[0031]6、本发明中制备固定化酶的工艺流程简单，使用材料价格低廉，成本较低。
【附图说明】
[0032]图1:本发明的反应流程图
【具体实施方式】
[0033]以下实施例将对本发明做进一步的说明。
[0034]实施例1
[0035]南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的活力为2256U/mL，体积500L，使用带夹套搅拌罐降温预冷至20°C。
[0036]预柱直径30cm，高200cm(径高比1:6.67)，取爾4-11大孔树脂1001^乍为预柱填料(树脂与发酵上清液体积比为1:5)，加入50L甲醇浸泡，使用50L甲醇进行湿法装柱(装柱量0.71BV)，使用200L甲醇作为流动相进行清洗，流速150L/h(流速1.06BV/h)，甲醇清洗后使用300L蒸馏水将甲醇洗出，流速150L/h(流速1.06BV/h)。
[0037]吸附柱直径20cm，高200cm(径高比1:10)取HPD600大孔树脂50L作为吸附柱填料(树脂与发酵上清液体积比为1:10)，加入30L甲醇浸泡，使用20L甲醇进行湿法装柱(装柱量0.80BV)，使用100L甲醇作为流动相进行清洗，流速75L/h(流速1.19BV/h)，甲醇清洗后使用150L蒸馏水将甲醇洗出，流速75L/h(流速1.19BV/h)。
[0038]使用预冷的发酵上清液上样，上样流速20L/h(以吸附柱计为0.32BV/h)，先后通过预柱和吸附柱。
[0039]吸附开始每隔lh测定预柱出口处收集液的总蛋白含量。
[0040]吸附开始每隔2h测定吸附柱出口处液体的脂肪酶B活力，吸附时间超过12h时每15min对上述参数进行测定。
[0041 ] 吸附前14h吸附柱出口处液体的脂肪酶B活力为5?15U/mL，吸附至14.5h时酶活力阶跃至1951U/mL，树脂已由白色变为浅黄绿色，此时已处理295L发酵上清液，判断为终点，停止上样。
[0042]预柱出口处的蛋白含量未发生阶跃，树脂未完全变色，可继续使用。
[0043]配制pH = 8.0的NaOH稀溶液60L(0.96BV)，以流速75L/h(流速1.19BV/h)冲洗吸附柱。
[0044]配制氯化锌浓度为0.01mol/L，pH=6.5的0.1mol/L磷酸盐缓冲液65L(1.05BV)，使用40L此溶液以流速75L/h(流速1.19BV/h)冲洗吸附柱，之后用剩余25L溶液将柱内树脂洗出至滤筒，浸洗搅拌I Omin，抽去液体。
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