一种具有缓解pfoa毒害功能的植物乳杆菌及其应用
【专利说明】一种具有缓解PFOA毒害功能的植物乳杆菌及其应用 【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种具有缓解PF0A毒害功能 的植物乳杆菌及其应用，本发明还涉及所述植物乳杆菌的用途。 【【背景技术】】
[0002] 全氟辛酸(Perfluorooctanoate，PFOA)是当今世界上最受关注的一种全氟类有机 酸，其自身具有优良的化学稳定性、热稳定性，还具有较高的疏水疏油的特性，在碳氧化合 物极低的情况下能在其表面使氟化物具有极高的表面活性，是合成聚四氟乙烯化工产品的 重要原料，被人们普遍大量的用于工业生产和使用的生活消费品中。由于具有稳定的化学 性质，PF0A在环境中很难被降解，从而造成其在环境中长期稳定地存在，而一旦进入生物 体，这些化合物就很难被排出体外或者被分解。研究表明，PF0A在人体内的半衰期为3.8年。 其进入生物体内，不易在脂肪中富集，而是更易与蛋白结合存在于血液、肝脏等组织器官 中。与此同时，PF0A的高稳定性使得其在生物体内不断积累，具有生物富集性以及沿食物链 的生物放大效应。其所造成的环境问题己遍布全球各处，重多研宄人员将其视为持久性有 机污染物家族的新成员而对其进行更为深入且全面的研究。毒理学研究发现PF0A具有肝脏 毒性、免疫毒性、生殖毒性、胚胎发育毒性、致癌性等。肝脏作为动物个体生命活动中的重要 器官，其担负机体主要代谢和解毒功能，同时肝脏也是PF0A的主要靶器官之一，也是PF0A引 起毒性的一个重要作用部位。2005年，美国环保局科学顾问委员会根据有关的毒理学数据， 提议PF0A为一种"可疑致癌物质"。
[0003] 考虑到PF0A对生态环境和人类健康的潜在威胁，包括美国杜邦公司和瑞士汽巴公 司等知名化工企业在内的所有8家仍在使用PF0A的公司也已同意最迟于2015年停止生产或 使用PF0A。发达国家对于PF0A的生产和使用的禁令也正在酝酿之中。我国PF0A的生产和使 用情况则不容乐观。中国氟硅有机材料协会的梅胜放指出，我国专门生产PF0A的企业至少 有2家，另有约8家企业生产氟聚合物，全都使用PF0A作为乳化剂，每年的使用量约为100吨。 PF0A类化合物在全球环境介质中的广泛存在，可以通过饮食、呼吸等途径进入到人体和生 物体内，对人体和生物体造成伤害。作为一种新兴污染物，PF0A的相关研究尚处在起步阶 段，目前研究主要集中在环境介质中污染状况的调查分析及毒性研究，关于PF0A的治理研 究主要集中在吸附和降解2种方式。而对于由PF0A中毒引起的各种生理病症，目前主要研究 其毒性机理，尚没有开发有效的药物来治疗其带来的毒性损伤。但是PF0A的蓄积毒性和中 毒症状引起了越来越多的关注，因此寻找一种新的干预或治疗方法显得十分必要。
[0004] 乳酸菌是一类能够使碳水化合物发酵并产生乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然 发酵乳制品、发酵植物食品，如泡菜、酸菜、青贮饲料以及人肠道中。长期科学研究结果表 明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生 理功能有:防治乳糖不耐症、恢复人体肠道内菌群平衡维护人体健康、抗肿瘤和预防癌症作 用、控制人体内毒素水平、抗氧化作用、保护肝脏并增强肝脏的解毒等功能。乳酸菌作为一 种食品级的微生物，不像螯合剂有严重的毒副作用，且已有诸多报道表明其在体外、体内对 重金属等污染物具有较好的吸附作用，很有潜力成为具有吸附PFOA，保护机体避免PFOA造 成损伤的新型保健食品。因此，筛选出一种对PF0A具备优良耐受和吸附能力以及具有强抗 氧化能力的乳酸菌，并且证明它们在动物模型中具有良好的缓解PF0A毒性损伤作用，同时 研制这些乳酸菌实际的用途就显得十分必要。本发明试图进一步地挖掘益生菌的功能，开 发具有更高保健价值的乳酸菌，为利用膳食策略缓解由PF0A导致的中毒效应开辟出新的途 径和解决方案。 【
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM738。
[0006]本发明是通过下述技术方案实现的。
[0007]本发明涉及一种乳酸菌，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特 性对该乳酸菌鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM738，该菌株已于2015年 10月8日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 11471。
[0008] 所述的植物乳杆菌CCFM738具有下述性质：
[0009]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
[0010]⑵在体外含有PF0A的培养基中培养，对PF0A有良好的耐受能力；
[0011]⑶在体外含有PF0A的水溶液中孵育，对PF0A有良好的吸附能力；
[0012]⑷具有缓解PF0A暴露小鼠中毒症状，改善PF0A暴露小鼠肝损伤程度的作用。
[0013]所述的植物乳杆菌CCFM738在制备缓解PF0A中毒的药物组合物与/或发酵剂中的 应用也属于本发明要求保护的范围。
[0014] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的药物组合物是由植物乳杆菌CCFM738菌 剂与在药学上可接受的载体组成的。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的植物乳杆 菌CCFM738菌剂是将含有所述植物乳杆菌CCFM738的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其 它方法制备所得到的粉剂，它含有1 〇6CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM738。
[0015]根据本发明的另一种优选实施方式，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在 药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。
[0016]根据本发明的另一种优选实施方式，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、 丸剂或口服液剂型。
[0017]根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的：
[0018] A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计87.7 %水将10 %酶水解脱脂乳、 0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨与0.3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8,这样得到所述的 培养基；
[0019] B、保护剂的制备:使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/ L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸钠的保护剂；
[0020]C、将植物乳杆菌CCFM738菌种按照以所述培养基的重量计2-4%接种量接种到在 温度110-120°C下灭菌8-12min的所述培养基中，在温度37°C下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓 冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度101()CFU/ml;接着，让该悬浮液在温度37°C下预 培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。
[0021 ]下面将更详细地描述本发明。
[0022] 本发明涉及一种植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)CCFM738，该菌株已于 2015年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类学命名为植 物乳杆菌Lactobacillusplantarum，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编 号为CGMCCNo.11471。
[0023] 本发明人根据下述筛选标准，通过大量筛选实验与分析验证，从我国传统食品，例 如泡菜，发酵奶酒中筛选出的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM738具有下述性 质：
[0024]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
[0025]⑵在体外含有PF0A的培养基中培养，对PF0A有较好的耐受能力；
[0026]⑶在体外含有PF0A的水溶液中孵育，对PF0A有良好的吸附能力；
[0027]⑷具有缓解PF0A暴露小鼠中毒症状，改善PF0A暴露小鼠肝损伤程度的作用。
[0028]下面将详细描述这些实验与分析认证结果。
[0029] 1、具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好
[0030]将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM738接种于MRS培养基(例如青岛海博生物技 术有限公司的产品）中，在温度37°C下培养18h，再经MRS培养液传代培养2~3次后，以1 %的 接种量分别接种于不同pH值(3.0-9.0)的MRS液体培养基中，在温度37°C下培养18h，测定初 始和培养结束后的〇D6QQ值，利用这个值测量在细菌培养液中的细胞浓度，从而估计细菌的 生长情况。OD600值是采用分光光度法在波长600nm处测定的细菌培养液的吸光值，它通常用 于表示在细菌培养液中细胞浓度，以确定液体培养物中细菌的生长情况。
[0031] 试验结果证明植物乳杆菌CCFM738在PH3.0-9.0的环境中生长良好，因此得以进行 后续实验。采用与前面所述的同样培养方式，用l.OmLpH7.2PBS(磷酸盐缓冲液)清洗菌体 两次，再用l.OmLpH7.2磷酸盐缓冲液重悬，其重悬乳杆菌菌体与9.OmLpH2.5人工胃液混 合，然后在温度37°C下进行培养，分别在开始(Oh)和3h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养 进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在第3h时的活菌 数对数值与在第〇h时活菌数对数值之比，以％表示。本发明筛选存活率在80 %以上的菌株 进行后续研究。
[0032] 实验结果表明，植物乳杆菌CCFM738在pH2.5的人工胃液环境中的存活率在90%以 上。由此可见，植物乳杆菌CCFM738具有耐酸性，在pH2.5的环境下存活良好。
[0033] 2、在体外含PF0A的培养基中培养，对PF0A具有良好的耐受能力 [0034] 植物乳杆菌CCFM738对PF0A耐受能力通过最低抑制浓度（MIC)方法测定。配制 100mg/L的PF0A溶液作为PF0A的母液，并用孔径大小为0.22μπι的无菌过滤器进行过滤。将除 菌