Pcsk9抗体、其药物组合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学和分子生物学领域，涉及一种PCSK9抗体、其药物组合物及其 用途。具体地，本发明涉及PCSK9的单克隆抗体。
【背景技术】
[0002] 前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9型（Proproteinconvertasesubtilisin/ kexintype9，PCSK9)是一种具有前蛋白转化酶活性的枯草溶菌素蛋白酶。PCSK9在肝脏、 小肠和肾脏中表达量较多，在皮肤、神经系统中有少量表达。肝脏中的PCSK9可以分泌到 血循环中，并通过结合与内吞作用降低细胞表面低密度脂蛋白受体（LDLreceptor，LDLR) 的数目。因为LDLR可以从血浆中高效消除LDL，LDLR受体数量减少可促使LDL积聚，所以 PCSK9所介导的LDLR降解，可以提高血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)的水平。PCSK9参 与富含甘油三脂的载脂蛋白B的脂代谢，PCSK9的分泌能提高肠道甘油三脂（TG)的水平，从 而参与诱发高胆固醇血症（RashidS.，etal·，Proproteinconvertasesubtilisinkexin type9promotesintestinaloverproductionoftriglyceride-richapolipoprotein Blipoproteinsthroughbothlow-densitylipoproteinreceptor-dependent and-independentmechanisms.Circulation. 2014Jul29 ; 130 (5):431-4L)〇
[0003] 高胆固醇血症病人中有29%的病人在使用他汀类药物。不能耐受他汀类药物和他 汀类药物不能达到所需血脂胆固醇水平的患者占高胆固醇血症病人的8. 2%。全球七大药 物市场（不包括中国）共有高胆固醇血症病人3亿9千万。2004年10月12日，卫生部公 布的《中国居民营养与健康状况调查》报告显示，我国成人高血压患病率为18. 8%，估计全 国患病总数为1. 6亿人，比1991年增加了 7000多万人。全国血脂异常患者也已达到1. 6 亿人。
[0004]目前，尚需要开发新的能够特异作用于人类PCSK9的免疫治疗抗体，其可结合至PCSK9并阻断PCSK9与LDLR的结合。阻断PCSK9与LDLR的结合可以提高细胞表面LDLR的 数量，提高LDL和所携带胆固醇的代谢，防治和减少高胆固醇血症所引起的心血管疾病。尤 其需要开发高效能的PCSK9抗体，其还能够同时提高甘油三脂（TG)代谢或降低TG水平，甚 至能够在较长的时间内维持功效。
【发明内容】
[0005] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种PCSK9单克隆抗体。本发 明人惊奇地发现，本发明的单克隆抗体能够很好地特异性与PCSK9结合，并且能够十分有 效地阻断PCSK9与LDLR的结合，提高细胞表面LDLR的数量，提高LDL和所携带胆固醇的代 谢，提高甘油三脂（TG)代谢，具有用于制备防治高胆固醇血症所引起的心血管疾病的药物 的潜力。由此提供了下述发明：
[0006] 本发明的一个方面涉及一种单克隆抗体，其包括：
[0007] 重链可变区，其包含氨基酸序列为（或者包含）SEQIDN0:17 - 19的⑶R;和/或
[0008] 轻链可变区，其包含氨基酸序列为（或者包含）SEQIDNO: 20 - 22的⑶R。
[0009] 抗体治疗药物，特别是单克隆抗体（MAB)已在多种疾病的治疗中取得了良好的疗 效。获取这些治疗性抗体的传统实验方法是采用抗原免疫动物，在免疫动物体内获取靶向 抗原的抗体，或通过亲和力成熟的方法来改进那些与抗原的亲和力较低的抗体。然而，这些 方法需要大量时间和精力，大多数时候也并不能针对抗原上的特定表位。
[0010] 轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互 补决定区（CDR)(重链（H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3,轻链（L)的CDR包含LCDR1、 LCDR2、LCDR3;其由Kabat等人命名，见SequencesofProteinsofImmunological Interest,FifthEdition(1991)，第 1-3 卷，NIHPublication91-3242,BethesdaMd)〇
[0011] 本发明人创造性地构建了 6个CDR区的氨基酸序列，并做特定修改以提高抗体可 变区对抗原的结合活性。为配合在CDR区的改动，框架区也同时被修改，但是需要确保这些 框架区的修改仍与人源的种系序列相兼容。框架的修改也将同时进行分析，以确保这些改 变对CDR区与抗原的结合没有影响。
[0012] 本发明重链可变区的3个⑶R如下：
[0013]HCDR1：GFTFSSYS(SEQIDNO：17)
[0014]HCDR2：ISSSSSYI(SEQIDNO： 18)
[0015]HCDR3：EYDFWSAYYDAFDV(SEQIDNO： 19)
[0016] 轻链可变区的3个⑶R如下：
[0017]LCDR1:SRNIGGGND(SEQIDNO:20)
[0018]LCDR2:GVI(SEQIDNO:21)
[0019] LCDR3:QSFDGSLSGSV(SEQIDNO:22)。
[0020] 在本发明的一个实施方案中，涉及一种单克隆抗体，其包括：
[0021] 重链可变区，其氨基酸序列为（或者包含）SEQIDN0:14 ;和/或
[0022] 轻链可变区，其氨基酸序列为（或者包含）SEQIDN0:16。通过本领域技术人员所 熟知的技术手段，例如通过美国国立生物技术信息中心网站（NCBI)，分析该单克隆抗体重 链可变区和轻链可变区的互补决定区（⑶R)，其亦分别如上面的SEQIDN0:17 - 19和SEQ IDN0:20 - 22所示。在本发明中，将该单克隆抗体命名为ΜΑΒΙ。
[0023] 根据本发明任一项所述的单克隆抗体，其中，其重链恒定区为小鼠抗体的重链恒 定区或人抗体的重链恒定区，其轻链恒定区为小鼠抗体的轻链恒定区或人抗体的轻链恒定 区。
[0024] 本发明的另一方面涉及一种分离的核酸序列，具体地，所述核酸序列为SEQID NO: 13和SEQIDNO: 15所示的核苷酸序列；其编码SEQIDNO: 14和SEQIDNO: 20所示的 氨基酸序列。
[0025] 本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其含有本发明任一项所述的核苷酸序 列；具体地，所述核酸构建体为重组表达载体；更具体地，为重组原核表达载体或重组真核 表达载体。
[0026] 本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明任一项所述的核酸构建 体；具体地，所述重组宿主细胞为重组原核细胞或者重组真核细胞。
[0027] 本发明的再一方面涉及一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其 中，所述单克隆抗体为本发明中任一项所述的单克隆抗体，所述偶联部分为选自放射性核 素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种；具体地，所述偶联部分为 蓖麻毒素；更具体地，所述偶联部分为蓖麻毒素A链。
[0028] 本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或者本发明任一项所 述的单克隆抗体偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗高血压、高胆固醇、高胆固醇 血症及其所引起的心血管疾病的药物中的用途。
[0029] 本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或者本发明任一项所 述的单克隆抗体偶联物在制备如下的药物或者试剂中的用途：
[0030] 特异性与PCSK9结合的药物或者试剂，
[0031] 阻断PCSK9与LDLR结合的药物或者试剂，
[0032] 提高细胞表面LDLR数量或者血浆中LDLR水平的药物或试剂，
[0033] 降低血浆中LDL或LDL-C水平的药物或试剂，
[0034] 降低血浆中TG水平的药物或试剂，
[0035] 抑制血浆中LDL积聚的药物或试剂，
[0036] 抑制PCSK9所介导的LDLR降解的药物或试剂，或者
[0037] 提高LDL所携带胆固醇的代谢水平和/或提高TG代谢水平的药物或者试剂。
[0038] 本发明人还通过实验（体内实验）发现，本发明的PCSK9抗体能够有效地降低血 浆中LDL和/或LDL-C水平，并且能在更长时间（可达17天）降低血浆中LDL和/或LDL-C 水平。特别是出乎意料地发现，本发明的PCSK9抗体还能降低体内血清的TG水平，并且效 果能够维持长达13天。目前现有技术中，尚未有任何PCSK9抗体能够实现这一技术效果。
[0039] 本发明的再一方面涉及一种在体内或体外的方法，包括使用有效量的本发明中任 一项所述的单克隆抗体或者本发明任一项所述的单克隆抗体偶联物的步骤，所述方法选自 如下：
[0040] 治疗和/或预防和/或辅助治疗高血压、高胆固醇、高胆固醇血症及其所引起的心 血管疾病的方法，
[0041] 特异性与PCSK9结合的方法，
[0042] 阻断PCSK9与LDLR结合方法，
[0043] 提高细胞表面LDLR数量或者血浆中LDLR水平的方法，
[0044] 降低血浆中LDL或LDL-C水平的方法，
[0045] 降低血浆中TG水平的方法，
[0046] 抑制血浆中LDL积聚的方法，
[0047] 抑制PCSK9所介导的LDLR降解的方法，或者
[0048] 提高LDL所携带胆固醇的代谢水平和/或提高TG的代谢水平的方法。
[0049] 本发明中部分术语的解释：
[0050] 多核苷酸
[0051] 本发明还涉及含有编码本发明所述单抗的重链可变区和/或轻链可变区的核酸 序列的分离多核苷酸。在一个优选实施方案中，该核酸序列包含编码SEQIDN0:18或20 所示的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，该多核苷酸包含SEQIDNO:17或19的核 苷酸序列。本发明的核酸序列包括基因组序列，以及相应的cDNA和RNA序列。此处所用术 语"核酸序列"应理解为包括合成DNA在内的所有这类变种。
[0052] 核酸构建体
[0053] 本发明还涉及包含本发明所述核酸序列及与之可操作连接的一个或多个调控序 列的核酸构建体，所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行 表达。表达应理解为包括多肽（单抗）生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、