[0270] 本发明可使用与上述序列的序列同一性至少约10 %、约15 %、约20 %，优选地至少 约25 %、约30 %、约40 %、约50 %、约55 %、约60 %、约65 %、约70 %、约75 %、约80 %、约85 %、 约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列。
[0271] 为了增加被引入的酶在本发明所述的真核细胞中以活性形式表达的可能性，可修 改相应的编码核苷酸序列以将其密码子使用(codon usage)优化为所选真核宿主细胞的密 码子使用。编码酶的核苷酸序列相对于所选宿主细胞的密码子使用的适应性可被表示为密 码子适应指数(CAI)Z'密码子适应指数"在本文中被定义为:一个基因的密码子使用相对高 表达基因的密码子使用的相对适应性的度量值。每种密码子的相对适应度(w)指的是对于 同一个氨基酸，该密码子相对于最高丰度密码子的使用率。CAI被定义为这些相对适应性数 值的几何平均数。非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)被排除在外。CAI值在0-1 之间，较高的值表示最高丰度的密码子的比例较高（参见Sharp和Li，1987，Nuclei C Acids Research 15:1281-1295;亦可参见：Jansen 等人，2003，Nucleic Acids Res.31(8):2242_ 51)。优选地，经修改的核苷酸序列的CAI值至少为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7。
[0272]在一个优选的实施方式中，用核苷酸序列遗传修饰根据本发明所述的真核细胞， 其中使用密码对优化技术(如在PCT/EP2007/05594中所公开的）修改所述核苷酸序列的密 码子使用为真核细胞的密码子使用。密码对优化技术是用于在宿主细胞中产生多肽的方 法，其中就编码多肽的核苷酸序列的密码子使用(尤其是被使用的密码对)对核苷酸序列进 行修饰，以改善编码多肽的核苷酸序列的表达和/或提高多肽的产量。密码对被定义为:编 码序列中的一组2个连续的三联体(密码子）。
[0273]可利用公知的方法(例如易错PCR或定向进化)进一步提高本发明所述的真核宿主 细胞体内酶的活性。W003010183和W003010311中描述了定向进化的优选方法。
[0274] 根据本发明的微生物可以是微生物来源的任何合适的宿主细胞。优选地，所述宿 主细胞是酵母或丝状真菌。更优选地，所述宿主细胞属于下述属之一：Saccharomyces、 Aspergillus、PeniciIlium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、 Humicola、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、Pachysolen或Yamadazyma或 Zygosaccharomyces 〇
[0275] 更优选的微生物属于下述物种：Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、 Pichia stipidis、Kluyveromyces marxianus、K.lactis、K.thermotolerans、Yarrowia lipolytica、Candida sonorensis、C·glabrata、Hansenula polymorpha、Torulaspora delbrueckii、Brettanomyces bruxe11ensisnZygosaccharomyces bailii、Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanusg!cSaccharomyces cerevisiae。优选的真核细胞是 Saccharomyces cerevisiae。
[0276] 可修饰根据本发明所述的重组酵母细胞以使ERG9基因被下调和/或ERG5/ERG6基 因被删除。在其它微生物中，可用相同的方法修饰相应的基因。
[0277] 可以用本文所述的方法转化这种微生物，通过将核苷酸序列转化至所述微生物使 细胞能够产生二萜或二萜糖苷。
[0278] 根据本发明的优选微生物是酵母，例如Saccharomyces cerevisiae或Yarrowia lipolytica细胞。本发明所述的重组微生物（例如重组的Saccharomyces cerevisiae细胞 或Yarrowia lipolytica细胞)可包括以下每组中的一种或多种核苷酸序列：
[0279] (i)SEQ ID 腸：1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、152、153、154、159、160、182或 184〇
[0280] (ii)SEQ ID N0:9、ll、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、 183或184。
[0281] (iii)SEQ ID 恥：21、23、25、6785、145、161、162、163、180或186。
[0282] (iv)SEQ ID 恥：27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185。
[0283] 这种微生物通常还包括一种或多种如SEQ ID N0:53、55、57或77中所示的核苷酸 序列。
[0284] 这种微生物还可以包括一种或多种如SEQ ID N0:35、37、39、41、43、45、47、49、51、 71、73、75、168、169、170、171、172、173、174、175、176、147、148、149、87、181、99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、189、190、191或192中所示的核苷酸序列。对于这些序列，来自以下每组中至少一种序 列的组合可能是优选的，其中所述组是：（i)SEQ ID N0:35、37、168、169、71、147Sl89;(ii) SEQ ID N0:87、99、101、103、105、107、109、lll、18lSl92;(iii)SEQIDN0:39、41、43、45、 47、170、171、172、173、174、73、148Sl90jP(iv)SEQIDN0:49、51、175、176、75、149Sl91。 通常可以使用至少一种组（i)的UGT。如果使用了至少一种组（iii)的UGT，那么通常也使用 至少一种组（i)的UGT。如果使用了至少一种组（iv)的UGT，那么通常使用至少一种组（i)的 UGT和至少一种组（i i i)的UGT。通常使用至少一种组（i i)的UGT。
[0285] 这种微生物还可以包括下述核苷酸序列：SEQ ID N0:79、81和83。
[0286] 对于上述每种序列(或本文提及的任何序列），可以使用与所述序列的序列同一性 至少约15%，优选地至少约20 %、25 %、约30 %、约40 %、约50%、约55%、约60 %、约65 %、约 70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的变体。
[0287] 可将编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶、 贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香 叶基二磷酸合酶、NADPH-细胞色素 p450还原酶的核苷酸序列连接至一个或多个核酸构建体 以促进根据本发明所述的微生物的转化。
[0288] 核酸构建体可以是质粒，所述质粒带有编码上述二萜(例如甜菊醇/甜菊糖苷)途 径中的酶的基因；或者核酸构建体可包括两个或三个质粒，其中每个质粒分别带有3个或2 个基因，这些基因以任意恰当的方式分布并编码二萜途径中的酶。
[0289] 可以使用任何合适的质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。
[0290] 选自内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶和贝壳 杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基 二磷酸合酶和NADPH-细胞色素 p450还原酶的酶可以源于宿主微生物，这样就可以不需要用 一种或多种编码这些酶的核苷酸序列转化而使宿主细胞产生二萜或二萜糖苷酶。可以通过 经典的菌株改良方法，进一步提高利用宿主微生物生产二萜/二萜糖苷酶的产量。
[0291] 核酸构建体可以维持游离状态，因此其包括自主复制的序列，例如常染色体复制 序列。如果宿主细胞是真菌来源，那么合适的游离核酸构建体可以，例如基于酵母2μ或pKDl 质粒(Gleer等人，1991，Biotechnology 9:968-975)或者ΑΜΑ质粒(Fierro等人，1995，Curr Genet·29:482-489)〇
[0292] 或者，可以将每种核酸构建体以单拷贝或多拷贝整合至宿主细胞的基因组。可以 通过非同源重组将核酸构建体随机整合至宿主细胞的基因组，但优选地通过本领域公知的 同源重组（参见例如恥90/144234?-4-04810084?-4-0635 574和1^ 6,265，186)实现。
[0293] 任选地，核酸构建体中可存在选择标记。本文中使用的术语"标记"涉及编码允许 选择或筛选含有此标记的微生物的性状或表型的基因。标记基因可以是抗生素抗性基因， 能够通过使用恰当的抗生素从未被转化的细胞中选出被转化的细胞。或者还可以使用非抗 生素抗性标记，例如营养缺陷型标记(1]1^3、了1^1、1^1]2)，被这种核酸构建体转化过的宿主 细胞可以不含有标记基因。EP-A-0635574中公开了构建不含重组标记基因的微生物宿主细 胞的方法，该方法基于双向标记的使用。或者，可以使可筛选的标记(例如绿色荧光蛋白、半 乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、葡糖醛酸酶)成为本发明所述的核酸构建体的一部分以筛 选被转化的细胞。W00540186中描述了引入异源多聚核苷酸的优选的无标记方法。
[0294] 在一个优选的实施方式中，编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内 根-贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和NADPH-细胞色素 p450还原酶的核苷酸序列各自与 启动子操作性连接，所述启动子能够使根据本发明所述的真核细胞中相应核苷酸序列充分 表达，从而使细胞能够产生二萜或二萜糖苷。
[0295] 本文中使用的术语"操作性连接"指的是多聚核苷酸元件(或编码序列，或核酸序 列）以功能关系连接。当一种核酸序列与另一种核酸序列存在功能关系时，则该核酸序列被 与另一种核酸序列"操作性连接"。例如，如果一个启动子或增强子影响编码序列的转录，那 么它与编码序列操作性连接。
[0296] 本文中使用的术语"启动子"涉及控制一个或多个基因转录的核酸片段，其位于基 因转录起始位点的上游(相对于转录方向），在结构上可以根据依赖DNA的RNA聚合酶结合位 点、转录起始位点和任何其它的DNA序列（包括但不局限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和 激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接地从启动子调控转录量的任何 其它核苷酸序列）的存在来鉴定。"组成型"启动子指的是在大部分环境和发育条件下活跃 的启动子。"诱导型"启动子指的是在环境或发育调控下活跃的启动子。
[0297] 能够被用来表达编码上文所定义的酶的核苷酸序列的启动子可以不源于编码要 表达的酶的核苷酸序列，即启动子和与其操作性连接的核苷酸序列（编码序列）是异源的。 优选地，启动子是同源的，即相对于宿主细胞是内源的。
[0298] 在本发明所述的微生物中，合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、 ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、1]1^3、1^1]2 4腸、了？1和六(^1。其它合适的启动子包括 PDC、Grol、PGKl、TEFl和TDH。实施例中陈述了其它合适的启动子。
[0299] 本发明可以使用任何在细胞中有功能的终止子。优选的终止子是从宿主细胞的天 然基因中获得的。合适的终止子序列是本领域公知的。优选地，在本发明的宿主细胞中，这 种终止子与阻止无义介导的mRNA降解的突变体结合（参见实施例：Shirley等人，2002， Genetics 161:1465-1482)。
[0300] 本发明中使用的核苷酸序列可以包括将其锚定至微生物的期望隔室的序列。例 如，在本发明所述的一种优选的微生物中，除内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶 和NADPH-细胞色素 p450还原酶的编码序列外的所有核苷酸序列都可被锚定至细胞溶质。可 以在酵母细胞中使用这种方法。
[0301] 当使用术语"同源的"表示给出的（重组)核酸或多肽分子与给出的宿主生物体或 宿主细胞之间的关系时，可以理解为:本质上，核酸或多肽分子由一种宿主细胞或相同物种 (优选的是相同变体或菌株)的生物体产生。
[0302]当使用术语"异源的"表示核酸(DNA或RNA)或蛋白质时，其中所涉及的核酸或蛋白 质在自然条件下并不作为其存在的生物体、细胞、基因组或者DNA或RNA序列的一部分出现， 或者是与在自然界发现的不同的细胞、位置、基因组或者DNA或RNA序列中发现的核酸或蛋 白质。异源的核酸或蛋白质相对于其被引入的细胞不是内源的，但它是从另外一种细胞或 者合成或重组生产获得的。
[0303]本发明的重组微生物通常包括异源的核苷酸序列。或者本发明的重组微生物可包 括被修饰(如本文所述)的完全同源的序列，以便所述微生物比同种但未被修饰的微生物产 生更大量的二萜和/或二萜糖苷。
[0304]可过表达一种或多种本文所述的二萜途径中的酶以利用细胞产生充足的二萜。 [0305]本领域存在多种用以在本发明的宿主细胞中过表达酶的有效方法。特别地，可以 通过增加宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数以过表达该酶，例如通过将基因的额外拷贝整 合至宿主细胞的基因组中。
[0306]根据本发明所述的优选的宿主细胞可以是天然能够产生GGPP的重组细胞。
[0307]根据本发明所述的重组微生物可以在本领域已知的任意合适的碳源上生长并将 其转换为二萜或二萜糖苷。所述重组微生物可直接转换植物生物质、纤维素、半纤维素、果 胶、鼠李糖、半乳糖、海藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、 乳糖和甘油。因此，一种优选的宿主生物体表达酶，例如将纤维素转换为葡萄糖单体所需的 纤维素酶（内纤维素酶和外纤维素酶）、将半纤维素转换为木糖和阿拉伯糖单体所需的半纤 维素酶(例如内木聚糖酶、外木聚糖酶、阿拉伯糖酶）、能够将果胶转换为葡萄糖醛酸和半乳 糖醛酸的果胶酶或者能够将淀粉转换为葡萄糖单体的淀粉酶。优选地，所述宿主细胞能够 转换的碳源选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖和甘油。所述宿主细胞可以是，例如如 在恥03/062430、1006/009434』？149970881、102006096130或恥04/099381中描述的真核宿 主细胞。
[0308] 另一方面，本发明涉及一种生产二萜或二萜糖苷的方法，其中所述方法包括在合 适的发酵培养基中发酵根据本发明的已被转化的真核细胞；以及任选地，回收二萜和/或二 萜糖苷。
[0309] 在生产二萜和/或二萜糖苷的方法中使用的发酵培养基可以是任何能使特定真核 宿主细胞生长的适合的培养基。发酵培养基的基本元素是本领域的技术人员已知的，并可 针对所选宿主细胞进行修改。
[0310] 优选地，发酵培养基包括选自植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳 糖、海藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪 酸、甘油三酯和甘油的碳源。优选地，发酵培养基还包括氮源，例如尿素或者铵盐(例如硫酸 铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵）。
[0311] 可以以分批、补料分批或连续的模式实施根据本发明的发酵方法。也可采用分步 水解发酵(SHF)法或同时糖化发酵(SSF)法。为了达到最佳生产力，还可以将这些发酵方法 的模式结合。在发酵方法中，如果使用淀粉、纤维素、半纤维素或果胶作为碳源，那么SSF方 法可能特别有吸引力，该方法中可能需要加入水解酶，例如纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶 以水解底物。
[0312] 在制备二萜和/或二萜糖苷的方法中使用的重组微生物可以是任何如上文所定义 的适合的微生物。在生产二萜和/或二萜糖苷的方法中，使用根据本发明的重组真核微生物 可能是有利的，因为大部分真核细胞不需要无菌条件来增殖而且对噬菌体感染不敏感。此 外，真核宿主细胞可以在低pH条件下生长以避免细菌污染。
[0313] 根据本发明的重组微生物可以是兼性厌氧微生物。在有氧条件下，兼性厌氧微生 物能够增殖至高细胞浓度。然后可以在高细胞密度时进行厌氧阶段，高细胞密度不仅大幅 度减少了需要的发酵体积，而且可以最小化好氧微生物污染的风险。
[0314] 根据本发明所述的生产二萜的发酵方法可以是有氧的或厌氧的发酵方法。
[0315] 厌氧发酵方法在本文中可被定义为:在没有氧气或实质上没有氧气可用（优选的 少于5、2.5或lmmol/L/h)的条件下运行的发酵方法，其中有机分子起着电子供体和电子受 体的作用。根据本发明的发酵方法还可以首先在有氧条件下运行，然后在无氧条件下运行。 [0316] 还可以在氧限制（〇^；5^]1-1；[111；!^(1)或微有氧(111；[01'0-361'013；!^1)条件下运行所述 发酵方法。或者，可以先在有氧条件下、然后在氧限制条件下运行所述发酵方法。氧限制发 酵方法指的是耗氧量受到从气体输送至液体的氧气的限制。氧限制的程度取决于进入气流 的量和组分以及所使用的发酵设备的实际混合/传质性能。
[0317] 根据本发明所述的方法中，可以在宿主细胞的生长期或静止(稳态)期生产二萜， 或者在这两个阶段均生产二萜。可以在不同的温度下运行所述发酵方法。
[0318] 可以在最适合真核细胞的温度下生产二萜或二萜糖苷。最适宜的生长温度可因各 种被转化的真核细胞而异，这是本领域的技术人员已知的。所述最适宜的温度可能比最适 合野生型生物体的温度高，以便生物体在非无菌条件下，在感染敏感性最小和冷却成本最 低时高效生长。或者，可以在并非最适合重组微生物生长的温度下实施该方法。事实上，我 们已经证明在低于最适合重组微生物生长的温度下实施制备二萜或二萜糖苷的方法可能 是有益的。
[0319] 在生产二萜或二萜糖苷的方法中，重组微生物的生长温度可以高于20°C、22°C、25 °C、28°C或高于30°C、35°C或高于37°C、40°C、42°C，优选地低于45°C。然而在二萜或二萜糖 苷的产生阶段，最适宜的温度可能低于平均温度以优化生物质的稳定性。这个阶段的温度 可以低于45°C，例如低于42°C、40°C、37°C，例如低于35°C、30°C或者低于28°C、25°C、22°C或 者低于20°C，优选地高于15°C。
[0320] 因此，本发明提供一种制备二萜或糖基化的二萜的方法，所述方法包括在约29°C 或更低的温度下，在适合的发酵培养基中发酵能够产生二萜或糖基化的二萜的重组微生 物；以及任选地，回收二萜或糖基化的二萜。所述微生物可以是根据本发明的微生物。
[0321] 这种方法中的发酵温度可以是约29°C或更低、约28°C或更低、约27°C或更低、约26 °C或更低，或者更低的温度。
[0322] 可以在任意合适的pH值下实施根据本发明的生产二萜或二萜糖苷的方法。如果重 组微生物是酵母，那么发酵培养基优选的pH值低于6，优选地低于5.5，优选地低于5，优选地 低于4.5，优选地低于4，优选地低于3.5或低于3.0或低于2.5，优选地高于2。在这些低pH值 下实施发酵过程的一个优势在于，可以防止发酵培养基中污染细菌的生长。
[0323]可以以工业规模实施这种方法。
[0324] 这种方法的产物可以是甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙 B、莱鲍迪戒C、莱鲍迪戒D、莱鲍迪戒E、莱鲍迪戒F、甜茶苷、杜克戒A中的一种或多种。优选 地，产生莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D。
[0325] 可以使用本领域已知的方法，例如通过蒸馏、真空抽提、溶剂抽提或蒸发从发酵培 养基中回收二萜或二萜糖苷。
[0326] 根据本发明所述的生产二萜或二萜糖苷的方法中，获得的发酵液的浓度可超过 5mg/l，优选地超过10mg/l，优选地超过20mg/l，优选地超过30mg/l，优选地超过40mg/l，更 优选地超过50mg/l，优选地超过60mg/l，优选地超过70mg/l的发酵，优选地超过80mg/l，优 选地超过l〇〇mg/l，优选地超过lg/Ι，优选地超过5g/l，优选地超过10g/l的，但通常低于 70g/l〇
[0327] 本发明还涉及一种发酵液，所述发酵液包括利用根据本发明的方法可得到的二萜 和/或二萜糖苷。其中所述二萜或二萜糖苷可以是甜菊糖苷，尤其是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙 D〇
[0328] 如果二萜或二萜糖苷表达于微生物中，那么可能需要处理这种细胞以释放二萜/ 二萜糖苷。
[0329] 本发明还涉及将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜的方法，其中所述方 法包括：
[0330] 将所述初次糖基化的二萜与本文所述的微生物、来源于这种微生物的无细胞提取 物或者来源于上述微生物或无细胞提取物之一的酶制剂接触，
[0331 ]从而将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜。
[0332] 二次糖基化的二萜可能是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D。特别地，可以以某种方式实施 所述方法以使初次糖基化的二萜是莱鲍迪甙A以及二次糖基化的二萜是莱鲍迪甙D。
[0333] 利用根据本发明的发酵方法产生的二萜或二萜糖苷(例如莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙 D)可用于这些化合物已知的任何应用中。特别地，例如它们可以在，例如食品或饮料中被用 作甜味剂。例如，甜菊糖苷可以被调配在软饮料中，可以用于桌面甜味剂（tabletop sweetener )、口香糖、乳制品（例如酸奶(例如原味酸奶））、蛋糕、谷物或基于谷物的食品、营 养食品、药物、食用胶、糖果食品、化妆品、牙膏或者其它口腔组合物等。此外，二萜或二萜糖 苷作为甜味剂不仅能够用于饮料、食品和其它专供人类消费的产品，而且还能够用于具有 改良特性的动物饲料。
[0334] 因此，本发明此外还提供包括根据本发明的方法制备的二萜或二萜糖苷的食品、 饲料或饮料。
[0335] 在生产食品、饮料、药品、化妆品、桌面产品、口香糖时，可使用常规方法，例如混 合、揉捏、溶解、酸洗、渗透、过滤、喷洒、雾化、浸泡和其它方法。
[0336] 对于在本发明中得到的二萜或二萜糖苷，可