使用光热平台向活细胞中的高通量运输物递送的利记博彩app
【专利说明】使用光热平台向活细胞中的高通量运输物递送
[0001]相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的USSN61/799,222的权益和优先权，其全文出于 所有目的以引用的方式并入有本文。
[0003] 关于联邦资助研究开发下完成的发明的权利声明
[0004] 本发明在政府支持下进行，由国家健康协会授予的资助号ΕΒ014456支持。政府享 有本发明的一定权利。
[0005] 背景
[0006] 将运输物(cargo)传递至宽尺寸范围的哺乳动物细胞中，包括蛋白质、DNA、RNA、染 色体、细胞核以及无生命的颗粒，如量子点、表面增强拉曼散射(SERS)颗粒、以及微珠，在很 多生物学领域中是非常需要的。递送方法如内吞作用能够使运输物内陷在核内体中，其中 低pH微环境和裂解酶经常使得运输物降解(Luo和 病毒递送和化学物递送方法将运输物包裹在病毒内或形成增强摄取的化学复合物 (Naldini 等人（1996)Science，272:263-267;Felgner 等人（1987) ?『〇(：.他七1.4〇&(1.3(^.1^4,84:7413-7417)。然而，毒性、细胞类型特异性摄取以及更重要的 是受限的运输物包裹能力对运输物尺寸和可传递的细胞类型施加重要的约束（Luo和 Saltzman，同上。) 〇
[0007] 物理传递方法包括电穿孔(Chu等人（1987)Nucleic Acids Res. 15:1311-1326)和 声致穿孔(Mitragotri (2005)Nat ·Rev·Drug Discovery，4:255-260)，这些是产生随机分布 的纳米级孔的方法，以及光穿孔(Tirlapur和Konig( 2002 )Nature, 418:290-291; Vogel等人 (2005)Appl.Phys.B:Laser Opt.，81:1015_1047;Clark等人（2006)J.Biomed.0pt. ,11: 014034)，这是一种通过激光焦点在细胞膜上产生孔的方法。小的运输物通过热扩散或通过 电场经由这些孔递送至细胞中。然而，由于随着孔径的增加运输物扩散速度降低且细胞活 力降低，所以使用这些方法递送大的运输物具有较低的效率（Stevenson等人（2006) Opt.Express，14:7125-7133)。
[0008] 微毛细管注射使用锐利的玻璃尖端来机械地穿透细胞膜用于递送(参见，例如， King(2004)Meth.Mo.Biol.,245：Gene Delivery to Mammalian Cells 1；Humana Press Inc. Totowa，NJ)。但是，为了维持细胞活力，来自膜穿透的机械性创伤将典型的移液管尖端 直径限制在约0 · 5um(参见，例如，Han等人（2998) J·Nanomed·Nanotechno 1 ·Biol .Med·，4: 215-225)〇
[0009] 由于移液管堵塞和运输物剪切，所以大于移液管尖端的运输物不能被注射。电注 射(一种将电穿孔与微毛细管注射结合的方法）已经证明了小分子如RNA和质粒DNA向活细 胞中的递送（参见，例如，Boudes等人（208)J.Neurosci .Meth·，170:204-211 ;Kitamura等人 (2008)Nat.Meth. ,5:61-67等）以及细菌向人工脂囊泡中的递送(参见，例如Hurtig和Orwar (2008)Soft Matter，4:1515-1520)。电注射通过用电场弱化细胞膜，然后进行轻柔的机械 穿透至细胞中而发挥作用。
[0010]简单的脂质辅助显微注射（31^1〇技术〇^€3行311和他116?(1998)8丨〇?1^8.了·， 75:2558-2563)在玻璃微毛细管的尖端处并入有合成的脂质分子。SLAM微量移液管与细胞 膜的接触允许脂质分子与细胞膜融合以形成用于运输物递送的连续的和临时的路径。这一 方法避免了微量移液管尖端穿过细胞膜造成的z字形刺穿动作的问题。然而，运输物与细胞 膜之间的亲脂性相互作用会在细胞中产生不想要的生物效应，同样，在递送的运输物下，也 将此方法限制于特定的细胞类型和运输物含量。
[0011 ] 概述
[0012] 在某些实施方案中，提供用于递送试剂(例如，核酸、蛋白质、有机分子、细胞器、抗 体或其它配体等)至活细胞中和/或从所述细胞中提取这些试剂的方法、装置和系统。在不 同的实施方案中，提供允许有效地、高通量地将运输物递送至活细胞中的光热平台和并入 有这种光热平台的系统。
[0013] 在不同的方面，本文设想的发明可包括但不限于，任何一个或多个以下实施方案： [0014]实施方案1: 一种用于递送试剂至细胞中的装置，所述装置包括多孔膜，其上沉积 有当暴露于光学辐射时变热的材料的薄膜涂层，其中所述薄膜涂层基本上沉积在包括所述 多孔膜的孔内并且所述多孔膜的表面基本上没有所述涂层。
[0015] 实施方案2:如实施方案1所述的装置，其中在沉积所述薄膜之前，所述多孔膜的平 均孔径在约l〇〇nm至约3μηι的范围内。
[0016] 实施方案3:根据实施方案1-2中任一个所述的装置，其中所述薄膜包含选自由以 下组成的组的材料:金、银、钛(Ti)、TiN、TiCn以及TiAIN。
[0017] 实施方案4:根据实施方案1-2中任一个所述的装置，其中所述薄膜包含钛。
[0018] 实施方案5:根据实施方案1-4中任一个所述的装置，其中所述薄膜的厚度范围在 约10nm至约Ιμπι内。
[0019] 实施方案6:根据实施方案1-5中任一个所述的装置，其中所述多孔膜包括多孔氧 化铝(Α12〇3)结构。
[0020] 实施方案7:根据实施方案1-5中任一个所述的装置，其中所述多孔膜包括聚酯膜。
[0021] 实施方案8:根据实施方案1-7中任一个所述的装置，其中所述多孔膜与多个细胞 接触或并列相邻。
[0022] 实施方案9:如实施方案8所述的装置，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
[0023] 实施方案10:-种用于递送试剂至细胞中的装置，所述装置包括：刚性基底，其包 括第一表面和在与所述第一表面相对侧上的第二表面以及微孔口阵列，其中所述微孔口从 所述第一表面穿过所述基底至所述第二表面，其中所述微孔口具有小于约ΙΟμπι的最大直 径，并且多个所述微孔口的至少一部分壁或边缘和/或与所述微孔口相邻的所述第一表面 的区域用当暴露于光学辐射时变热的材料的薄膜涂层涂覆；以及设置在邻近所述第二表面 处的流体通道或流体贮存器，其中所述通道或贮存器与包括所述微孔口阵列的多个微孔口 流体连通;并且其中所述第一表面的面被设置来接收并支持和/或容纳细胞。
[0024] 实施方案11:如实施方案10所述的装置，其中所述微孔口具有约5μπι或更小的最大 直径。
[0025] 实施方案12:如实施方案10所述的装置，其中所述微孔口具有约3μπι或更小的最大 直径。
[0026] 实施方案13:根据实施方案10-12中任一个所述的装置，其中所述刚性基底由微光 刻晶片形成。
[0027] 实施方案14:根据实施方案10-13中任一个所述的装置，其中所述刚性基底由选自 由以下组成的组的材料形成:硅、石英、刚性聚合物以及陶瓷。
[0028] 实施方案15:根据实施方案10-13中任一个所述的装置，其中所述刚性基底由硅形 成。
[0029] 实施方案16:根据实施方案10-15中任一个所述的装置，其中所述刚性基底，其中 所述第一表面包括被构造来容纳细胞并设置用于显微镜观察的腔室的表面。
[0030] 实施方案17:如实施方案16所述的装置，其中所述腔室具有开放的顶部。
[0031] 实施方案18:如实施方案16所述的装置，其中所述腔室具有封闭所述腔室的顶部。
[0032] 实施方案19:根据实施方案10-18中任一个所述的装置，其中所述微孔口阵列包括 至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少50个、至少100个、至少200个或至 少500个微孔口。
[0033]实施方案20:如实施方案19所述的装置，其中所述孔口全部位于所述表面约2cm2 或更小，或者约1.5cm2或更小，或者约lcm2或更小，或者约0.5cm2或更小，或者约0. lcm2或更 小的面积内。
[0034]实施方案21:根据实施方案10-20中任一个所述的装置，其中所述薄膜沉积在所述 微孔口的一部分壁和/或一部分边缘上。
[0035] 实施方案22:根据实施方案10-21中任一个所述的装置，其中所述薄膜包括选自由 以下组成的组的材料:半导体、金属、金属合金、金属氮化物以及金属氧化物。
[0036] 实施方案23:如实施方案22所述的装置，其中所述薄膜包括选自由以下组成的组 的材料:过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物以及过渡金属氧化物。
[0037] 实施方案24:如实施方案22所述的装置，其中所述薄膜包括选自由以下组成的组 的材料:金、银、钛(Ti)、TiN、TiCn以及TiAIN。
[0038] 实施方案25:根据实施方案10-24中任一个所述的装置，其中所述流体通道或腔室 装置容纳待递送至细胞中的试剂。
[0039] 实施方案26:如实施方案25所述的装置，其中所述试剂选自由以下组成的组：核 酸、核酶、蛋白质或肽、酶、抗体、细胞器、染色体、病原体以及微粒或纳米颗粒。
[0040] 实施方案27:根据实施方案10-26中任一个所述的装置，其中所述通道或腔室被加 压。
[0041] 实施方案28:如实施方案27所述的装置，其中所述通道或腔室通过气体压力、栗或 重力供料进行加压。
[0042]实施方案29:根据实施方案10-28中任一个所述的装置，其中所述装置被配置来替 代倒置显微镜上的载物台。
[0043]实施方案30:根据实施方案10-29中任一个所述的装置，其中细胞设置在所述第一 表面上。
[0044]实施方案31:如实施方案30所述的装置，其中所述细胞设置在所述基底的多个微 孔口上或邻近所述多个微孔口。
[0045]实施方案32:根据实施方案30-31中任一个所述的装置，其中所述细胞为哺乳动物 细胞。
[0046] 实施方案33: -种用于选择性地开放递送试剂至细胞中的系统，所述系统包括:根 据实施方案1-9中任一个所述的装置和/或根据实施方案10-32中任一个所述的装置；以及 能够加热所述薄膜的光能来源。
[0047] 实施方案34:如实施方案33所述的系统，其中所述光能来源为激光或非相干光源。 [0048]实施方案35:如实施方案34所述的系统，其中所述光能来源为激光。
[0049]实施方案36:根据实施方案33-35中任一个所述的系统，其中所述系统包括透镜系 统、系统和/或掩模，和/或引导光能至所述第一表面或所述多孔膜的特定区域的定位系统。
[0050] 实施方案37:根据实施方案33-36中任一个所述的系统，其中所述系统包括被配置 来将光能聚焦到所述第一表面或所述多孔膜上的物镜。
[0051] 实施方案38:如实施方案37所述的系统，其中所述系统包括半波板