转化为半胱氨酸的鸡抗体和使用其的位点特异性缀合的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用半胱氨酸残基修饰的改造的鸡抗体，更具体地涉及具有治疗或诊断 疾病应用的抗体。半胱氨酸修饰的抗体可以与化学治疗药物、毒素、肽、亲和配体（如生物 素）、和检测标记(如放射性同位素和荧光团）缀合，并且用于诊断或治疗疾病。
【背景技术】
[0002] 抗体广泛用于诊断和治疗。抗体可以通过与药物、酶、染料、肽、适体、接头、毒素、 同位素等化学结合而具有改善功能或可以具有新的功能。在与这些物质的化学结合中，涉 及到官能团如抗体的酪氨酸残基的0H基团、赖氨酸残基的NH 3基团，或天冬氨酸或谷氨酸的 羧基基团（文献[Goldenberg D.M.等人，J .MecL (医学杂志）（1978) 298: 1384-1386; Rainsbury R.M.等人，Lancet(柳叶刀）（1983)2:934_938;以及 Yamada H.等人， Biochemistry(生物化学）（1981 )20:4836-4842]) 〇
[0003]然而，这些官能团也存在于抗原结合位点中。因此，如果在化学结合中涉及抗原结 合位点中的残基，可能会影响抗体对抗原的亲和力。另外，在使用半胱氨酸的结合反应中， 抗体分子链(多肽）内或链之间的二硫键的还原是先决条件，其可以影响蛋白的活性(文献 [Stimmel J.B.等人，J.Biol.Chem. (2000)273:30445-30450])。另外，蛋白可以由于三级结 构的错折叠或损失而变得无活性或非特异性(文献[Zhang W.等人，Anal.Biochem.(分析生 物化学）（2002)311:1-9])。
[0004]位点特异性缀合优于随机的氨基修饰，因为其能够在远离结合位点的位点进行化 学修饰，促进生物学活性的完整保留和允许控制添加的辅基的可能数目。半胱氨酸改造的 抗体已通过接头在新引入的半胱氨酸硫醇上缀合硫醇反应性接头试剂和药物接头试剂，以 制备半胱氨酸改造的具有抗癌性能的抗体药物缀合物，例如，抗MUC16(US 2008/0311134)， 抗CD220JS 2008/0050310)，抗R0B04(US 2008/0247951)，抗TENB20JS 2009/0117100)，抗 CD79B(US2009/0028856;US 2009/0068202)Thio ADC。然而，人或其他动物中存在一个或多 个抗体重链和轻链可变区基因，并且因此，每个不同的抗体具有不同的构架序列。因此，存 在的问题是，应当针对相应的抗体优化半胱氨酸引入位点。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明的一方面提供了鸡抗体的构架片段，其中半胱氨酸残基被引入到重链可变 区或轻链可变区中存在的构架区中，包括该构架片段的重链可变区或轻链可变区，或包括 该重链可变区或轻链可变区的抗体。
[0007] 本发明的另一方面提供了包括抗体或其抗原结合片段的缀合物和缀合化合物，所 述缀合物通过使例如化学治疗药物、酶、适体、毒素、亲和配体、或检测标记的缀合化合物与 鸡抗体的构架片段、包括该构架片段的重链可变区或轻链可变区或包括该重链可变区或轻 链可变区的鸡抗体中存在的引入的半胱氨酸残基缀合来制备。
[0008] 又另一方面提供了包括抗体或其抗原结合片段的缀合物和缀合化合物在诊断或 治疗疾病中的用途。
[0009] 技术方案
[0010]本发明人已经从鸡抗体的重链可变区和轻链可变区的构架区中存在的多种氨基 酸残基选择了尽管被半胱氨酸取代也能够维持抗体活性和亲和力的残基，并且还提供了鸡 抗体的重链可变区和轻链可变区中的构架片段、包括该构架的重链可变区或轻链可变区、 以及包括重链可变区或轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，其中所述构架片段的特定氨 基酸被半胱氨酸修饰。
[0011] 优选地，引入半胱氨酸的位点不诱导在抗体分子之间形成二硫键，使得不形成二 聚体，或形成少量的二聚体。因此，维持了半胱氨酸的反应性。引入半胱氨酸的抗体或其抗 原结合片段容易地与缀合化合物(如化学治疗药物、酶、适体、毒素、亲和配体或检测标记） 结合，从而应用于诊断或治疗疾病的各个领域。
[0012] 另外，根据本发明的半胱氨酸修饰的构架，包括该构架的重链可变区或轻链可变 区以及包括重链可变区或轻链可变区的抗体或其抗原结合片段源自鸡抗体，并且鸡抗体具 有一个重链可变区基因和一个轻链可变区基因，与人或其他动物的抗体不同。为此，所有抗 体具有相同的构架。因此，在根据本发明的半胱氨酸修饰的构架或包括该构架的抗体中，半 胱氨酸位于同样的位置，并且因此同样地应用于鸡中产生的所有抗体。
[0013] 以下将更加详细地描述本发明。
[0014] 根据本发明的实施方式的抗体是包括构架的抗体，其中源自鸡抗体的重链可变区 和轻链可变区的构架区中存在的一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸取代。
[0015] 根据本发明的另一个实施方式的抗体是包括构架的抗体，其中源自鸡抗体的重链 可变区和轻链可变区的构架区中存在的一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸取代，并且作为 取代的半胱氨酸两侧的侧翼的两个氨基酸中的一个或多个额外地被选自由天冬氨酸、谷氨 酸、精氨酸和赖氨酸组成的组中的一个或多个带电荷的氨基酸取代。
[0016] 在本发明中，制备包括具有取代的半胱氨酸的构架的修饰的抗体通过使用具有一 个重链可变区基因和一个轻链可变区基因的鸡抗体进行，因此在不分别优化半胱氨酸残基 的引入位点的情况下可以迅速地制备半胱氨酸修饰的抗体，与人或其他动物的具有多种重 链和轻链可变区基因的抗体不同。
[0017] 在本发明中，抗体(半胱氨酸），其中源自鸡抗体的重链可变区和轻链可变区的构 架区中存在的一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸取代，具有的优点是，两个或更多个氨基 酸以及一个氨基酸被半胱氨酸取代，因此，两个缀合化合物缀合在其上，或两个或更多个不 同的缀合化合物缀合在其上以制备具有多种功能的缀合物。
[0018] 另外，根据本发明的修饰的抗体还具有的优点是，除了半胱氨酸取代外，作为被取 代的半胱氨酸两侧的侧翼的两个氨基酸中的至少一个氨基酸被选自由天冬氨酸、谷氨酸、 精氨酸和赖氨酸组成的组中的一个或多个带电荷的氨基酸取代，从而有效地诱导与具有相 反电荷的物质的共价键，并且抑制在具有相同局部电荷的半胱氨酸修饰的抗体之间形成二 硫键以防止抗体聚集，并且用带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸取代氨基酸抑制了马来酰亚胺 键的断裂(文献[Shen B.Q.等人，Nat.Biotechnol.(国家生物技术）（2012)30:184-189])。
[0019] 在本发明中，在可用半胱氨酸取代的位置的氨基酸是除半胱氨酸之外的氨基酸。 位于构架内的任何氨基酸均可被取代，只要其即使被半胱氨酸取代也能够维持抗体活性和 亲和力。
[0020] 满足上述条件的待取代的氨基酸位于鸡抗体的轻链可变区中存在的构架内，包括 SEQ ID N0:1 的构架 1、SEQ ID N0:2的构架2、SEQ ID N0:3的构架3、SEQ ID N0:4的构架4， 并且这些构架的结构如图la详细地示出。
[0021] 在本发明的实施方式中，修饰的抗体可以是仅包括轻链可变区的修饰的构架、仅 包括重链可变区的修饰的构架或包括轻链可变区的修饰的构架和重链可变区的修饰的构 架两者的抗体。
[0022] 在鸡抗体的轻链可变区中存在的构架中，待被半胱氨酸取代的氨基酸位于选自由 以下组成的组中的一个或多个位置:顺序编号的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的位置3、4、5、 12、和16(与按照Kabat编号的位置5、6、7、14和18对应），
[0023] 顺序编号的SEQ ID N0:2的氨基酸序列的位置31和40(与按照Kabat编号的位置37 和45对应），
[0024]顺序编号的SEQ ID N0:3的氨基酸序列的位置52、53、56、58、59、60、61、64、65、71、 78 和 82(与按照 Kabat 编号的位置 57、58、61、63、64、65、66、69、70、76、83和87对应），以及 [0025] 顺序编号的SEQ ID N0:4的氨基酸序列的位置98和102(与按照Kabat编号的位置 102和106对应）。
[0026]在轻链可变区中存在的构架内，可被半胱氨酸取代的氨基酸的位置如表la所示。 [0027][表la]轻链构架
[0028]
[0029]
[0030] 满足上述条件的待取代的氨基酸位于鸡抗体的重链可变区中存在的构架内，包括 SEQ ID N0:5的构架 1、SEQ ID N0:6的构架2、SEQ ID N0:7的构架3、SEQ ID N0:8的构架4， 并且这些构架的结构如图la详细地示出。
[0031] 在鸡抗体的重链可变区中存在的构架内，待被半胱氨酸取代的氨基酸位于选自由 以下组成的组中的一个或多个位置:顺序编号的SEQ ID N0: 5的氨基酸序列的位置1、3、5、 6、7、11、12、13、16、18、19、24和25(与按照1^匕&七编号的位置1、3、5、6、7、11、12、13、16、18、 19、24和25对应），
[0032] 顺序编号的SEQ ID勵:6的氨基酸序列的位置42和48(与按照1^&&丨编号的位置42 和48对应），
[0033] 顺序编号的SEQ ID勵:7的氨基酸序列的位置70、73、75、76、78、87、88、89、91和93 (与按照Kabat编号的位置69、72、74、75、77、83、84、85、87和89对应），以及 [0034] 顺序编号的SEQ ID N0:8的氨基酸序列的位置123和126(与按照Kabat编号的位置 110和113对应）。
[0035]在重链可变区中存在的构架内，可被半胱氨酸取代的氨基酸的位置如表lb所示。 [0036][表lb]重链构架
[0037] 123 另外，在轻链可变区中，待被半胱氨酸取代的氨基酸可以优选地位于选自由顺序 编号