及其分子诊断方法
【技术领域】
[0002] 本发明涉及抗性品种选育技术领域，更具体地，涉及鸡B亚群禽白血病抗性分子标 记tvb3731-3732insA及其分子诊断方法。
【背景技术】
[0003] 禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)引起的一种免疫抑制 性肿瘤性传染病，该病能引起多种具有传染性的良性和恶性肿瘤。感染鸡的禽白血病病毒 包括ALV A-E和J共6个亚群。B亚群禽白血病病毒(ALV-B)是我国禽白血病的主要病原之一， 能使感染鸡群发生免疫抑制、生产性能下降及特征性肿瘤而死亡，给世界养禽业造成巨大 的经济损失。目前，该病尚无商品化疫苗和有效的治疗方法，主要通过淘汰阳性鸡来净化种 鸡群和加强生物安全措施进行预防。然而，现有措施并不能控制AVL-B在中国的发生与流 行。近年的流行病学调查结果显示，AVL-B在我国商品肉鸡、蛋鸡、地方品系鸡和野生鸟类中 普遍存在，已成为威胁我国养鸡业(尤其是种鸡业)持续健康发展的重大疾病之一。因此，急 需研发更适合我国实情的禽白血病防控新策略。国外已有研究证实，从宿主遗传抗性方面 研究禽白血病的遗传抗病育种已成为防控该病的有效策略。
[0004] 发掘禽白血病遗传抗性功能基因或基因位点，并应用于筛选禽白血病遗传抗性特 异种质以培育禽白血病抗性鸡品种(系)是实现禽白血病遗传抗病育种的关键。
【发明内容】
[0005] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种鸡B亚群禽白血病抗性分子标记。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种诊断B亚群禽白血病抗性鸡的方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的： 一种鸡B亚群禽白血病抗性分子标记，所述分子标记为tvb受体基因第3731与3732位的 A插入突变。该位点简称为tVb3731_3732insA突变位点。
[0008] 本发明首次分析了中国鸡种tvb受体基因的遗传变异，发现中国鸡种中tvb受体基 因第3731与3732位存在A插入突变，发明人从体外、体内实验两个层面证实了该自然突变引 起宿主对ALV-B的感染产生遗传抗性。具体原因在于tvb受体基因第3731与3732位存在A插 入突变位于tvb受体基因第4外显子，从而导致tvb受体基因发生移位编码，推测其可能导致 tvb受体基因表达一个不适宜作为病毒受体的缺陷蛋白，从而引起宿主对ALV-B的感染产生 遗传抗性。
[0009] 因此，本发明保护如上所述分子标记在诊断B亚群禽白血病抗性鸡中的应用。
[0010] 依据tvb受体基因第3731与3732的A插入突变，本发明建立了一种诊断B亚群禽白 血病抗性鸡的方法，具体包括如下步骤： 51. 提取待测鸡血液DNA，以SEQ ID勵:7~8所示?4引物扩增包含切133731-3732^4突变位 点的tvb受体基因片段，测序后判断待测鸡的基因型； 52. 如待测鸡的基因型为tvbinsAAnsA，则为B亚群禽白血病抗性鸡，如待测鸡的基因型为 tvbs/insA或tvbsA，则为B亚群禽白血病易感性鸡。
[0011] 本发明在分析中国鸡种tvb受体基因的遗传变异时，除了发现tvb受体基因第3731 与3732位的A插入突变之外，还发现在tvb受体基因第3667与3668核苷酸位置中存在AG插入 突变，这两个自然突变均位于tvb受体基因第4外显子，从而均导致tvb受体基因发生移位编 码，推测其可能导致tvb受体基因表达一个不适宜作为病毒受体的缺陷蛋白，从而引起宿主 对ALV-B的感染产生遗传抗性。因此，本发明可以依据这两个自然突变位点建立一种诊断B 亚群禽白血病抗性鸡的方法，具体包括如下步骤： 51. 提取待测鸡血液DNA，以SEQ ID如：7~8所示？4引物扩增包含切133667-3668^4(；和 tvb37m32insA突变位点的tvb受体基因片段，测序后判断待测鸡的基因型； 52. 如待测鸡在tvb366^3668insAG突变位点的基因型为tvbinsAGAnsAG，则对ALV-B感染产生 遗传抗性，如待测鸡在tvb 3731_3732insA突变位点的基因型为tvbinsAAnsA，则对ALV-B感染产生 遗传抗性，如待测鸡在tvb 366^3668insA(^PtVb373P3732insA突变位点的基因型分别为tvb insA(VinsAe 和tvbinsVinsA，则对ALV-B感染产生遗传抗性。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明首次发现在中国鸡种中tvb受体基因第3731与3732位存在A插入突变，而且本发 明首次验证该突变引起宿主对ALV-B的感染产生遗传抗性。因此，将该突变位点作为鉴定鸡 B亚群禽白血病抗性的分子标记是非常准确的。以此突变位点建立的抗B亚群禽白血病遗传 标记的分子诊断方法，可应用于筛选ALV-B遗传抗性鸡品种(系）的育种素材，从而开展ALV-B遗传抗性鸡品种(系）的选育。
[0013] 本发明在分析中国鸡种tvb受体基因的遗传变异时，除了发现tvb受体基因第3731 与3732位的A插入突变之外，还发现在tvb受体基因第3667与3668核苷酸位置中存在AG插入 突变，以这两个自然突变位点建立的诊断B亚群禽白血病抗性鸡的方法，可应用于筛选ALV-B遗传抗性鸡品种(系）的育种素材，从而开展ALV-B遗传抗性鸡品种(系）的选育。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明的研究思路。
[0015] 图2为RCASBP⑶病毒感染tvb3667-3668insAGfe点不同基因型CEF细胞。
[0016 ] 图3为RCASBP⑶病毒感染tvb3731-3732ins%点不同基因型CEF细胞。
【具体实施方式】
[0017]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
[0018]实施例1 tvb受体基因的遗传变异分析 根据tvb受体基因已知DNA序列(GenBank登录号:NC_006109.3)，设计5对引物扩增tvb 基因全长序列5425bp，引物序列、位置及PCR扩增片段大小如表1所示。
[0019] 表1为tvb受体基因全长序列PCR扩增信息 提取中国鸡种血液样品的基因组DNA，用该5对引物扩增tvb受体基因全长序列。PCR反 应体系组成：模板lyL，10Xbuffer 2.5yL，dNTPs 2 yL，上下游引物各 1 yL，K0D-FX 0.25 μL，无菌水补至25μΙ^ΡΟ?反应程序:94°C预变性3min，1个循环;94°C 45s，58~65°C(不同引 物退火温度）90s，72°C 608,35个循环;72°(3后延伸101^11。？〇?产物在2%琼脂糖凝胶电泳检 测时可观察到P1~P5引物各自扩增的特异性条带，将PCR扩增产物进行克隆测序，分析tvb 受体基因的遗传变异。发明人随机分析了多个中国鸡品种(系)tvb受体基因的遗传变异，发 现中国鸡种tvb受体基因存在2种自然突变:在tvb受体基因第3667与3668核苷酸位置中插 入AG(tvb 3667-3668insAG)，在tvb受体基因第3731与3732核苷酸位置中插入A (tvb3731 -3732insA ^
[0020] 实施例2 tvb3667-3668insAG、tvb3731-3672insA突变致宿主抗ALV-Β感染的功能验证。
[0021 ] 1、体外细胞的功能验证:构建RCASBP(B)EGFP表达质粒，转染DF-I细胞7天后，收集 细胞上清液(上清液含携带EGFP荧光蛋白的RCASBP(B)病毒，即ALV-B病毒，可随后感染DF-I 和CEF细胞），测定病毒感染单位（IU)后，分装保存于-80°C^RCASBP(B)病毒分别感染tvb3667 -3668insAG、tvb373l-3732insA突变位点不同基因型 CEF，包括野生型tvb s/s CEF(对ALV_B易感）、杂 合突变型 tvbS/inSAG 和 tvbS/insA CEF 以及纯合突变型