一种可视化检测不同基因型蔓枯病菌的引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种可视化检测不同基因型蔓枯病菌的引物 及其应用。
【背景技术】
[0002] 蔓枯病是由瓜类壳二孢菌(Ascochyta citrullina Smith,其无性世代为泄根亚 隔孢壳Didymella bryoniae)引起的真菌病害，在瓜类的幼苗期至采收期均可发生。该病害 大多发生在植株茎基部和节间部，发病后致使整个植株失水枯萎而死亡。蔓枯病菌寄主范 围广泛，可危害萌芦科的甜瓜、黄瓜、西瓜、南瓜等多种经济作物。冬春日光温室及早春、秋 后大棚栽培均有发生，在生产上往往植株死亡率可达30 %~40 %，造成严重减产，目前其危 害程度远高于瓜类枯萎病和疫病，已成为制约瓜类生产的主要障碍。生产上早期蔓枯病与 枯萎病症状相似，所以建立蔓枯病菌的快速分子检测技术对于其引起的病害的早期控制具 有重要意义。
[0003] 目前蔓枯病菌根据RAHKrandom amplified polymorphic DNA)分子指纹图谱方 法主要区分为RG(RAPD Group)I、RG II和RGIV三个基因型，RG I和RG II为主导基因型 (Keinath et al.，1995;Santos et al.，2009;Somai et al. ,2002)。已经针对瓜蔓枯病菌 (D.bryoniae)的RAH)基因型靶序列开发出常规PCR和Real-Time PCR检测技术用于检测单 个RG基因型或广谱多个RG基因型蔓枯病菌的引物方法(Ha et al.，2009;Ling et al.， 2010)。但是常规PCR检测时间长、还有荧光定量PCR技术对于仪器条件要求高、检测过程复 杂，与目前需要快速、简便、可视化的检测技术要求不符。
【发明内容】
[0004] 解决的技术问题:本发明针对现有技术中蔓枯病菌的生物学检测方法所需检测时 间长、荧光定量PCR技术对于仪器条件要求高、检测过程复杂、成本高。提供一种可视化检测 不同基因型蔓枯病菌的引物及其应用。
[0005] 技术方案：一种可视化检测不同基因型蔓枯病菌的引物，由正向内引物DB17RG-FIP、反向内引物DB17RG-BIP、正向外引物DB17RG-F3、反向外引物DB17RG-B3和反向环引物 DB17RG-LB组成;各引物序列具体如下：
[0006] DB17RG-FIP:5' -GTGAGGGCCCTGAGATGTTTG-AATTATTCGCCTACAAGCCGC-3';
[0007] DB17RG-BIP:5' -CCGCATCCGACATCACCCTT-GCTTCGCCTTCCTCATCG-3';
[0008] DB17RG-F3:5'-AGACCGCACTTTCGAGCT-3';
[0009] DB17RG-B3:5'-GCGAACTGGCCAATGTGT-3';
[0010] DBHRG-LBj'-TCCACAAGGTCCCGCAAT-S'。
[0011]所述引物在广谱检测RG I和RG II两种基因型蔓枯病菌中的应用。
[0012] -种可视化检测不同基因型蔓枯病菌的试剂盒，含有所述的引物。
[0013]所述的试剂盒包含lmL检测溶液，所述的检测溶液包含:40μΜ正向内引物DB17RG- FIP、40μΜ反向内引物DB17RG-BIP、5μΜ正向外引物DB17RG-F3、5μΜ反向外引物DB17RG-B3、20 μΜ环引物DB17RG-LB、10mM dNTPs、20mM Tris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2S〇4、8mM MgS〇4、0.1%Triton X_100、Bst DNA polymerase 352单位，8μΜ|丐黄绿素（Calcein)，0.3mM MnCbo
[0014] 所述试剂盒广谱可视化检测不同基因型蔓枯病菌的方法，以提取的DNA为模板，利 用所述引物进行环介导恒温扩增反应;观察反应溶液颜色变化，黄绿色为蔓枯病菌;棕褐色 则无蔓枯病菌。
[0015] 所述试剂盒广谱可视化检测不同基因型蔓枯病菌的方法，提取待检微生物的DNA， 取2yL DNA模板，加入23yL试剂盒中的反应液中进行环介导恒温扩增反应，反应程序为:63 °C，40min〇
[0016] 本发明根据蔓枯病菌DB-RG I和DB-RG II(登录号：GQ872461，GQ872462)基因序 列，设计和优选出的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证不同（RG I和RG II) 基因型蔓枯病菌的特异性引物序列，本发明以3株RG I基因型蔓枯病菌株和2株RG II基因 型蔓枯病菌株及8种病原真菌为供试材料(表1)，采用商用DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Mini kit，Qiagen,Valencia，CA，USA)提取病菌菌丝DNA，加适量灭菌超纯水或TE(pH 8·0) 溶解沉淀DNA(含20yg/mL RNase)，-20°C保存备用。
[0017] 进行反应扩增时，阳性反应产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应液的浊度上 升。钙黄绿素显色发出黄绿色荧光结果显示，3株RG I基因型蔓枯病菌株和2株RG II基因型 蔓枯病菌反应管中均为黄绿色。其他为棕褐色阴性反应。因此，反应结束后通过反应体系的 颜色变化，来判断蔓枯病菌的有无。证明设计和优选的引物具有特异性。同时，反应产物经 2%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察扩增的反应产物，RG I和RG II基因型蔓枯病菌均出现 典型的梯状条带，而其它阴性对照无梯状条带。这说明该引物组合物可被用于RG I和RG II 基因型蔓枯病菌快速可视化的试剂盒鉴定，对蔓枯病菌的快速分子检测及病害的早期控制 具有重要意义。
[0018] 本发明提供的广谱、可视化检测不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌的检测方法， 具有广谱、快速、可视化、灵敏度高、成本低廉等特点。
[0019] 有益结果：1、广谱性：根据蔓枯病菌DB-RG I和DB-RG 11(登录号：GQ872461， GQ872462)基因序列，设计和优选出的高效特异扩增的引物，能同时实现不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌快速可视化的试剂盒鉴定。
[0020] 2、简单易行：本发明提供的检测不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌方法克服了 现有检测方法检测时间长、还有荧光定量PCR技术对于仪器条件要求高、检测过程复杂等问 题，本发明在63°C的等温条件下，能快速、方便、高效、特异、高灵敏地检测到不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌，成本低廉，仪器简单，恒温扩增，不需要PCR仪，能较好满足快速检测。 [0021 ] 3、实用性:整个扩增反应只要试剂盒提供反应液加检测目标DNA，完全通过颜色可 视化判断结果，不用开盖，减少污染可能性，步骤实用性强，增加了在农业生产中病害预警 监测的应用价值。
[0022] 4、灵敏度高：分别用稀释成不同浓度的DNA，作为模板，分别用本发明方法和常规 PCR法进行灵敏度检测，本发明提供的检测不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌方法检测下 限为1 f gyL-1，是常规PCR的1000倍；
[0023] 5、快速化:整个扩增反应试剂实现试剂盒化，无需重复加不同试剂、引物和酶等步 骤，一步反应，节省时间，实现快速化。通过正向内引物DB17RG-FIP、反向内引物DB17RG-BIP、正向外引物DB17RG-F3、反向外引物DB17RG-B3和反向环引物DB17RG-LB特异性识别靶 序列上的6个独立区域，其特异性和灵敏度都比较高。反向环引物LB能够大大提高反应速 率，使得反应时间只要40分钟，整个过程在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进 行不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌检测。；
[0024] 6、本发明为广谱、可视化检测不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌的检测提供了 新的技术平台，可用于不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌的快速可视化检测。这种方法快 速、可视化，对不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌的准确诊断，对病害早期预警、指导科学 用药、降低成本及减少环境污染具有重要的现实意义。
【附图说明】
[0025]图1为本发明对不同（RG I和RG II)基因型蔓枯病菌特异检测结果图。图1中（a)表 示显色结果，黄绿色为阳性，棕褐色为阴性;图1中（b)表示白色的焦磷酸镁沉淀浊度显示结 果；图1中（c)表示琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，1:蔓枯病菌（Didymella bryoniae DBJSJY-2RG I基因型）；2:蔓枯病菌(Didymella bryoniae DBAHHF-2RG II基因型）；3:蔓枯 病菌（Didymella bryoniaeDBZJNB_5RG II 基因型）；4:蔓枯病菌（Didymella bryoniaeDBJSNJ_60RG I基因型）；5:蔓枯病菌（Didymella bryoniae DBJSNJ-62RG I基因 型）；6:豌豆萎焉病菌（Ascochyta pinode