改善纤维素转化过程产率的方法
【专利说明】改善纤维素转化过程产率的方法
[0001 ]本申请是申请人于2007年11月13日提交的题为“改善纤维素转化过程产率的方法”的中国专利申请200780042148.X的分案申请。
[0002]1.由联邦政府资助研究开发的发明权利声明
[0003]本工作部分由美国能源部基本合同号DE-AC36-99G0 10337下的国家可再生能源实验室分包合同号ZC0-0-30017-01的合同提供资金。因此，美国政府可拥有本申请的某些权利。
[0004]2.相关申请的交叉引用
[0005]本申请要求于2006年11月13日提交的、美国临时申请系列号60/858,579、题为“改善纤维素转化过程产率的方法(Mehtod for Improving Yield of Cellulose Convers1nProcess)”的临时申请的优先权，其全部内容在此通过引用并入本文。
3.发明领域
[0006]本发明涉及改善纤维素物质的酶促转化中期望的糖的产率的方法。
[0007]4.发明背景
[0008]由纤维素物质生产糖，以及其后的发酵和将这些糖蒸馏进入乙醇中的技术在一段时间前即为已知。其较早的发展主要出现在二次世界大战期间，当时燃料对于德国、日本和苏联这样的国家非常珍贵。早期的方法主要集中在酸水解上，但其工程和设计相当复杂，且对于过程变量如温度、压力和酸浓度上小的变化非常敏感。“Product1n of Sugars FromWood Using High-Pressure Hydrogen Chloride,>,B1technology and B1engineering，卷XXV，2757-2773(1983)中对这些早期方法有广泛讨论。
[0009]二次世界大战到1970年代早期，石油的丰富供应减缓了对乙醇转化的研究。然而，由于1973的石油危机，研究者更多地致力于研发用木材和农业副产品生产乙醇作为替代能源的方法。此研究对于将乙醇发展为汽油添加物以减轻美国对于外国石油生产的依赖、提高燃料的辛烷值、降低作为环境标准的排气污染物尤为重要。
[0010]随着当前所知的“石油危机”，美国环境保护局(the Environmental Proctect1nAgency of the United States)公布了必须减少铅添加物的条例，以减少空气污染。在乙醇实质上可以取代铅的情况下，一些精炼厂选择了乙醇作为代用品，特别是它可以轻易地引入精炼厂的操作中，而无须昂贵的资本设备投入。
[0011]除了改善几十年前研发的高压高温的气体糖化作用方法之外，当前的研究主要集中在酶促转化过程。这些方法使用来自多种生物、可将纤维素降解为可发酵的糖的酶，这样的生物如嗜中温和嗜热真菌、酵母和细菌。对于这些方法和其扩大至商业化的能力以及乙醇生产的低效率，都仍存在不确定性。
[0012]纤维素和半纤维素是由光合作用产生的最丰富的植物材料。其可以被许多微生物降解而用作能量来源，这样的微生物包括细菌、酵母和真菌，它们产生的胞外酶能够将聚合底物水解为单体糖(Aro等人，2001)。生物体对于使用哪些糖通常是有限制的，这决定了在转化过程中最好生产哪些糖。随着对不可再生资源的限制的邻近，纤维素成为主要的可再生能源的潜力是巨大的(Krishna等人，2001)。通过生物学方法有效利用纤维素是克服食物、饲料和燃料短缺的的一个途径(Ohmiya等人，1997)。
[0013]纤维素酶是水解纤维素(β-1，4_葡聚糖或即_糖苷键)使之形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。纤维素酶惯例上分为三个主要类别:内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)( “EG” )、外切葡聚糖酶或称纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)( “CBH”)和β-葡糖苷酶([i3]-D-葡糖苷葡糖水解酶([P]-D_glucoside glucohydrolase) ；EC 3.2.1.21)( “BG” )。(Knowles等人，1987和Shulein，1988)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的非结晶部分，而纤维二糖水解酶还可以降解晶态纤维素。
[0014]在处理机械纸浆(Pere等人，1996)、用作饲料添加物(W0 91/04673)和在谷物湿磨中，纤维素酶也已被证实可用于将纤维素生物质降解为乙醇(其中纤维素酶将纤维素降解为葡萄糖，酵母或其它微生物再将葡萄糖发酵为乙醇)。单独糖化和发酵为这样的过程，其中生物质例如玉米秸杆中的纤维素转化为葡萄糖，然后酵母菌株将葡萄糖转化为乙醇。同时糖化和发酵为这样的过程，其中生物质例如玉米秸杆中的纤维素转化为葡萄糖，同时在同一反应器中，酵母菌株将葡萄糖转化为乙醇。由轻易可得的纤维素来源所生产的乙醇提供了稳定、可更新的燃料来源。
[0015]已知有许多细菌、酵母和真菌产生纤维素酶。某些真菌产生能够降解结晶形式纤维素的完整纤维素酶系(即完整纤维素酶)。为了将晶态纤维素有效地转化为葡萄糖，需要完整纤维素酶系包含各来自CBH、EG和BG类别的成分，还包含对于水解晶态纤维素作用较少的单独的成分(Filho等人，1996)。特别地，EG型纤维素酶和CBH型纤维素酶的组合相互作用，比单独使用任一种酶能更有效地降解纤维素(Wood，1985; Baker等人，1994;及Nieves等人，1995)。
[0016]此外，本领域已知纤维素酶可用于处理纺织品以提高洗涤剂组合物的清洁能力，用作软化剂，用于改善棉织物的触感和外观等(Kumar等人，1997)。对于清洁性能提高的(美国专利号4，435，307;英国申请号2，095，275和2，094，826)和用于处理织物改善纺织品触感和外观的含纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利号5，648，263、5，691，178和5，776，757，及英国申请号1，358，599)已有所描述。
[0017]因此，真菌和细菌中产生的纤维素酶受到了重大关注。特别地，已证实木霉属物种(Trichoderma spp.)(例如长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)或里氏木霉(Trichoderma reesei))的发酵产生能够降解结晶形式纤维素的完整纤维素酶系。多年来，木霉属纤维素酶的生产已通过经典诱变、筛选、选择和高度改进的、大规模廉价发酵条件的发展得到了改进。木霉属物种的多成分纤维素酶系能将纤维素水解为葡萄糖，还有来自其它微生物，特别是细菌菌株的具有不同性质、用于有效水解纤维素的纤维素酶，并且在丝状真菌中表达这些蛋白质用于工业规模的纤维素酶生产将十分有利。然而，许多研究结果表明丝状真菌中细菌酶的产率低(Jeeves等人，1991)。
[0018]可溶性糖，如葡萄糖和纤维二糖，在工业中对于生产化学产品和生物产品有许多用途。纤维素水解的优化使得可以使用更少量的酶，提高生产可溶性糖的成本效益。尽管研发了许多方法，本领域中仍需改善由纤维素物质获得的可溶性糖的产率。
[0019]5.发明简述
[0020]本发明提供了通过在处于或约为纤维素酶的热变性温度的温度下，将纤维素底物或预处理的纤维素底物与纤维素酶进行孵育，提高由纤维素起始材料的酶促糖化作用得到的可溶性糖的产率的方法。本发明还提供了通过在处于或约为纤维素酶的热变性温度的温度下，将纤维素底物或预处理的纤维素底物与纤维素酶进行孵育，提高由纤维素起始材料的酶促糖化作用得到的葡萄糖产率的方法。
[0021]本发明还提供了将纤维素物质转化为葡萄糖的方法，其通过组合纤维素物质与纤维素酶，将纤维素物质和纤维素酶的组合在高于约38°C的温度进行孵育，以引起水解反应，将至少20%所述纤维素物质转化为可溶性糖，其中葡萄糖的组分相对于可溶性糖至少为
0.75。本发明还提供了将纤维素物质转化为纤维二糖的方法，其通过组合纤维素物质与包含内切葡聚糖酶1的酶混合物，孵育纤维素物质和纤维素酶的组合以引起水解反应，将达50%的纤维素物质转化为可溶性糖，其中葡萄糖的组分相对于所述可溶性糖少于约0.5。
[0022]纤维素酶可以是由微生物产生的完整纤维素酶、纤维素酶混合物或其组合，所述微生物来自曲霉属(Aspergillus )、木霉属、镰孢属(Fusarium)、金小孢子属(Chrysosporium)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、脉抱菌属(Neurospora)、或其可选的有性型如裸孢壳属(Emericella)和肉座菌属(Hypocrea)(见Kuhls等人，1996)。优选地，可以使用物种如解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、嗜热放线菌(Thermobif ida fusca)、灰腐质霉(Humicola grisea)或里氏木霉。
[0023]本文提供了本发明的这些特点和其它特点。
[0024]6.附图简述
[0025]技术人员会理解附图目的仅为举例说明，而非旨在以任何方式限制本发明的范围。